李本淳 张强 张亦萌 马彧

（四平市食品药品检验所 吉林 四平 136000）

1 前言

杜仲叶是杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干燥叶，具有补肝肾、强筋骨的功效，可用于治疗肝肾不足、头晕目眩、腰膝酸痛、筋骨痿软。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，其衍生物有约20种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等，其中，B1的毒性最大，致癌性最强。

黄曲霉毒素主要存在于农产品、饲料和中药材中，温度、湿度、空气是黄曲霉毒素生长繁殖的必要条件。虽然《中国药典》2020年版规定了13种中药材的黄曲霉毒素限量，但部分市售药材仍存在黄曲霉毒素污染甚至超标等现象。相关研究发现，杜仲叶采摘后若不及时晾晒或贮藏方式不当，宜发霉变质，故本文采用高效液相色谱-光化学衍生法测定杜仲叶中黄曲霉毒素的含量，以期为杜仲叶的安全性评价提供参考。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

高效液相色谱仪（1260型，美国安捷伦）；均质器（青岛普瑞邦）；台式离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）；电子天平（BT125D型，赛多利斯）。

2.2 试剂

黄曲霉毒素混合对照品溶液（批号：610001-202006，特性量值：AFB1为1.04 μg/mL、AFB2为0.38 μg/mL、AFG1为1.08 μg/mL、AFG2为0.38 μg/mL，中国食品药品检定研究院，）；免疫亲和柱（青岛普瑞邦）。甲醇、乙腈均为色谱纯，氯化钠为分析纯，杜仲叶来源为市售，水为自制超纯水。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速：1 mL/min；激发波长：360 nm，发射波长：450 nm；柱温：30℃，进样量：20 μL。采用柱后光化学衍生法，荧光检测器，2个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

3.2 混合对照品溶液的制备

精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

3.3 供试品溶液的制备

取杜仲叶粉末约10 g（过2号筛），精密称定，置于均质瓶中；加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min（＞11 000 r/min），离心5 min（4 000 r/min）；精密量取上清液15 mL，置于50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10 min（4 000 r/min）；精密量取上清液20 mL，通过免疫亲合柱，流速3 mL/min；用20 mL水洗脱，弃去洗脱液，使空气进入，将水挤出；用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置于2 mL量瓶中；加入甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

3.4 空白溶液的制备

除不添加样品外，按“3.3”中的方法制备空白溶液，即得。

3.5 专属性试验

分别吸取空白溶液、对照品混合溶液和供试品溶液20 μL，在“3.1”中的色谱条件下进行测定。结果显示，各色谱峰分离良好，空白溶液无相同色谱峰出现，表明空白无干扰，见图1。

图1 杜仲叶黄曲霉毒素HPLC图

3.6 线性关系考察

分别精密吸取“3.2”混合对照品溶液5 μl、10 μl、15 μl、20 μl、25 μl、30 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（y），黄曲霉毒素的进样质量为横坐标（x），绘制标准曲线，进行回归计算。各成分在线性范围内均呈良好的线性关系。将黄曲霉毒素混合对照品溶液加入空白样品进行分析，以基线噪声（S/N>3）确定方法检出限，见表1。

表1 黄曲霉素度对照品线性关系及检出限

3.7 重复性考察

精密称取同一杜仲叶6份，每份10 g，分别精密加入对照品贮备液适量，按“3.3”中的方法制备供试品溶液，在“3.1”中的色谱条件下进行测定，测得4种黄曲霉毒素含量的RSD均在2.5%以内，表明该方法的重复性良好。

3.8 稳定性实验

分别于0、2、4、8、12和24 h，精密吸取重复性考察项同一供试品溶液20 μL，按“3.1”中的色谱条件进行测定，4种黄曲霉毒素峰面积的RSD均小于2.3%，表明供试品溶液中4种黄曲霉毒素在24 h内稳定性良好。

3.9 加样回收率实验

精密称取同一不含4种黄曲霉毒素的杜仲叶6份，每份10 g，分别精密加入对照品贮备液0.7 ml，按“3.3”中的方法制备供试品溶液，按“3.1”中的色谱条件进行测定，计算加样回收率。结果显示，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分别为94.0%、93.1%、92.7%、92.4%，RSD分别为2.5%、3.7%，3.5%，2.9%，表明该方法的回收率良好。

3.10 样品的黄曲霉毒素含量测定

取来自贵州、四川、安徽等地的杜仲叶15批，按“3.3”中的方法制备供试品溶液，按“3.1”中的色谱条件进行测定。结果显示，均未检出黄曲霉毒素。

4 讨论

本文通过对15批不同产地的杜仲叶中的黄曲霉毒素进行检测，结果表明，杜仲叶不易受到黄曲霉毒素的污染。我国常用中药有300余种，《中国药典》2020版仅对易产生黄曲霉毒素的果实、种子等类型的部分中药材做出了规定，但是其他类型的中药材在储存、运输过程中也有可能受黄曲霉毒素污染，应制定黄曲霉毒素快速检测方法，扩大考察中药材品种范围，应用现代的理化、生物技术对易霉变中药材开展科学的养护，保障中药的安全性。