李青松

（四川省绵阳市经济技术开发区动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000）

贾第虫是一种最常见的寄生生物，可感染人类和多种动物［1］。根据宿主和形态学分类，贾第虫被分为六个种，其中只有肠贾第虫（又名蓝氏贾第鞭毛虫、十二指肠贾第虫）可感染人类。肠贾第虫的基因型复杂，根据遗传学和表型，至少分为8 个集聚体（A～H）［2］。奶牛主要感染集聚体E，其次是集聚体A和B［3］。近年来许多对奶牛犊牛感染肠贾第虫的相关研究显示，奶牛犊牛断奶前后肠贾第虫的感染率存在差异，断奶前后犊牛感染肠贾第虫的基因型也有差异［4-14］。

本研究以成都部分地区（崇州、青白江、邛崃）奶牛场中的断奶犊牛为研究对象，采用巢式PCR扩增肠贾第虫β-贾第素（bg）基因、磷酸丙糖异构酶（tpi）基因和谷氨酸脱氢酶（gdh）基因位点，确定感染率，并对阳性样品进行集聚体鉴定。随后基于三个位点扩增出的序列，对断奶犊牛肠贾第虫进行亚型分析，最后建立系统发育树。旨在为奶牛场防治肠贾第虫感染以及肠贾第虫人兽共患病的监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Power Soil®DNA Isolation Kit（粪便DNA提取试剂盒），2×Taq PCR Master Mix，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 样品采集 在成都市崇州、青白江、邛崃的三个奶牛场采集圈养断奶犊牛（2～12月龄）的新鲜粪便共计104份，每份粪样约50 g，置于洁净塑料采样袋中，做好标记、编号，于4 ℃下保存备用。

1.3 样品处理 取每份粪便样品20 g，放入50 mL小烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌溶解并过滤。将滤液转移到50 mL 离心管内，以3 000 r/min 离心5 min，缓慢弃去上清液，保留沉淀物，一部分沉淀物直接用于DNA提取，另一部分沉淀物储存于2.5%重铬酸钾，并于4 ℃冰箱中保存。

1.4 DNA提取 样品处理后得到含粪便及卵囊的沉淀物，按照Power Soil®DNA Isolation Kit 说明书提取样本DNA。提取的DNA 置-20 ℃环境中保存。

1.5 PCR扩增 基于β-贾第素（bg）基因位点对所有样品进行检测，引物设计及扩增条件参照Sulaiman 等［15］的报道。基于β-贾第素基因鉴定出的阳性样品，使用磷酸丙糖异构酶（tpi）、谷氨酸脱氢酶（gdh）基因位点进行基因亚型鉴定，引物设计及扩增条件参照Appelbee 等［16］和Cacciò等［17］的报道。PCR反应体系均为25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、去离子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL（第1轮PCR 产物为第2 轮PCR 的模板）。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测第2 套巢式PCR 产物，置于凝胶成像仪内，使用Image Lab Version 3.0 软件成像拍照。

1.6 测序及分析 将PCR 阳性产物进行双向测序，通过DNAMAN Version 8.0 软件进行拼接。将测序结果在GenBank中经BLAST比对校正后，使用MEGA 7的NJ法构建系统发育树。

2 结果

2.1 巢式PCR扩增结果 基于巢氏PCR扩增β-贾第素（bg）基因位点、磷酸丙糖异构酶（tpi）基因位点、谷氨酸脱氢酶（gdh）基因位点的目的基因条带长度分别为511 bp、532 bp、520 bp。

2.2 断奶犊牛肠贾第虫感染情况 所采集的104 份样品中共有42 份鉴定为肠贾第虫阳性，总感染率为40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崃三个奶牛场的感染率分别为46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），三个奶牛场皆发现了集聚体E和集聚体A感染。具体感染情况见表1。

表1 断奶犊牛肠贾第虫感染情况统计

2.3 bg、tpi和gdh基因序列分析 经过多次巢氏PCR扩增bg、tpi、gdh三个位点，分别扩增出11、8、9 条基因序列，分别发现6 种基因亚型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 种基因亚型（A1、E3、E6、E15、E22），6 种基因亚型（A1、E1、E8、E10、E12、E13）。基因型和基因亚型检测结果见表2。

表2 基于bg、gdh和tpi位点的肠贾第虫基因型和基因亚型检测结果

基于bg 基因位点，11 条序列中以A1（n＝2）和E1（n＝2）基因亚型为主。形成的6 种基因亚型在NCBI的序列登录号分别为A1（KR051222）、E1（KT922247）、E2（KT922248）、E9（KY769091）、E11（KY769089）、E13（MF671880），据此构建出bg基因位点的系统进化发育树。

基于tpi基因位点，8条序列中以A1（n＝3）和E3（n＝2）基因亚型为主。形成的5种基因亚型在NCBI 的序列登录号分别为A1（KJ888991）、E3（KT922259）、E6（KY432850）、E15（KY432848）、E22（KY710748），据此构建出tpi基因位点的系统进化发育树。

基于gdh基因位点，9条序列中以A1（n＝2）、E1（n＝2）和E10（n＝2）基因亚型为主。形成的6种基因亚型在NCBI 的序列登录号分别为A1（KT922255）、E1（KY769096）、E8（KT369785）、E10（KT698971）、E12（KY432840）、E13（KY432838），据此构建出gdh基因位点的系统进化发育树。

3 结论与分析

3.1 肠贾第虫感染情况 我国断奶犊牛感染肠贾第虫的情况非常普遍，但感染率多数偏低。通过多基因位点分析结果可知，本研究中断奶犊牛肠贾第虫的总感染率为40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崃三个奶牛场的感染率分别为46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），高于广东（0.94%）［7-8］、吉林（4.39%）［9］、宁夏（2.53%）［9］、江苏（7.48%）［10］、河北和天津（3.48%）［11］、河南（2.42%）［12］、陕西（17.54%）［13］、新疆（16.60%）［14］。表明这些场中断奶犊牛感染肠贾第虫的情况较为严重，可能是不同气候生态条件、管理水平等因素综合作用的结果。提示成都地区奶牛场中肠贾第虫可能是一种常见的病原体，应当引起重视。

3.2 肠贾第虫基因型情况 本研究在bg、tpi、gdh三个基因位点分别扩增出了11、8、9条基因序列，分别形成6 种基因亚型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 种基因亚型（A1、E3、E6、E15、E22），6 种基因亚型（A1、E1、E8、E10、E12、E13），均为已知亚型，且主要为集聚体E，其次为集聚体A，此项结果与国内陕西［13］、新疆［14］地区的研究结果一致，故成都地区的奶牛场可参照这些地区的防控方法防治该病。通过系统发育树分析，三个奶牛场中断奶犊牛肠贾第虫集聚体E 的遗传种类多样，可能与集聚体的遗传重组有关。本研究发现的所有集聚体A均为A1亚型，这种亚型主要在动物身上发现，但也可以感染人类，这提示成都地区奶牛场肠贾第虫感染具有人兽共患风险，应当引起高度重视。■