何子骥，伍斌玺，李雨昕，沈志滨，刘奇越，王秋红，#（.广东药科大学中药学院，广州 50006；.黑龙江中医药大学教育部北药基础与应用研究重点实验室/黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，哈尔滨 50040；.广州采芝林药业有限公司，广州 5045）

车前子为车前科植物车前Plantago asiaticaL.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥成熟种子[1]，其性寒，味甘，具有清热利尿通淋、渗湿止渴、明目、祛痰的功效，主要用于治疗热淋湿痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤肿痛、痰热咳嗽等[2]。车前子主要含有多糖类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、三萜类、黄酮类、甾醇及生物碱类等化学成分[3]，具有利尿、消炎、降血糖、降血压、调血脂、抗氧化和调节免疫等药理作用[4]。

炒车前子为车前子炒制后的炮制品，除用于便秘的疗效显著外[5]，还可增强清热利尿、渗湿通淋的功效[6]。目前，关于炒车前子的研究主要为其炮制工艺优化[7－9]，以及以京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量为指标的质量标准研究[10]，加之关于车前子炒制前后整体化学成分变化以及炒车前子指纹图谱的研究较少，这使得难以综合评价车前子炒制前后的整体质量和特征成分。

中药指纹图谱技术结合聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘回归分析等化学模式识别分析能更加客观、全面地反映药材质量，已被广泛用于中药材的质量控制研究[11]。本课题组前期以2020年版《中国药典》（一部）车前子药材项下的京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量为指标，对车前子及炒车前子进行含量测定，结果显示，车前子中京尼平苷酸的含量为0.51%～1.38%，毛蕊花糖苷的含量为0.67%～1.06%；炒车前子中京尼平苷酸的含量为0.98%～1.47%，毛蕊花糖苷的含量为0.54%～0.94%，均符合药典规定[1]。基于此，本研究在车前子及炒车前子含量符合《中国药典》规定的基础上，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立了15批车前子与15批炒车前子的指纹图谱，同时结合化学模式识别分析方法比较车前子与炒车前子的质量差异，旨在为完善车前子与炒车前子的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Waters Alliance 型HPLC仪（美国Waters公司），MS105DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），Milli-Q Advantage A10 型台式纯水系统（德国Millipore 公司），C21-WK2102 型多功能电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

京尼平苷酸对照品（批号MB6001-S，纯度＞98%）、毛蕊花糖苷对照品（批号MB6742，纯度＞98%）均购自大连美仑生物技术有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

15 批车前子药材（编号S1～S15）均于2019 年购自广州采芝林药业有限公司，经广东药科大学中药学院中药资源系刘基柱教授鉴定为车前科植物车前P.asiaticaL.的干燥成熟种子。取15 批干净的车前子药材（编号S1～S15）适量，置于预热电磁炉中，炒至略有爆声并有香气逸出时，取出放凉，即得炒车前子（对应编号为S16～S30）。15批车前子与15批炒车前子来源信息见表1。

表1 15批车前子与15批炒车前子来源信息

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 以SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-0.5%乙酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，5%A；5～15 min，5%A→20%A；15～25 min，20%A→60%A；25～30 min，60%A；30～35 min，60%A→5%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备 取车前子或炒车前子样品粉末（过三号筛）1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密称定，加60%甲醇50 mL，精密称定；连接冷凝管加热回流提取2 h，放冷，再次精密称定，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；取续滤液，于25 ℃以13 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取京尼平苷酸、毛蕊花糖苷对照品各0.1 mg，分别加60%甲醇，制成京尼平苷酸、毛蕊花糖苷质量浓度均为0.1 mg/mL 的单一对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S11），按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，以京尼平苷酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.37%（n＝6），相对峰面积的RSD 为0.56%～1.62%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S11），分别于室温下放置0、2、4、6、8、16、18、24 h 时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以京尼平苷酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD 为0.09%～0.41%（n＝8），相对峰面积的RSD 为0.63%～1.95%（n＝8），表明供试品溶液于室温下放置24 h 内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取车前子（编号S11），共6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以京尼平苷酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD 为0.05%～0.41%（n＝6），相对峰面积的RSD 为0.27%～1.75%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.1.7 HPLC 指纹图谱的建立 分别取15 批车前子及15 批炒车前子样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，将得到的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，采用中位数法，车前子以S11样品为对照图谱，炒车前子以S26 样品为对照图谱（因S11、S26 样品的色谱峰峰形较好），时间窗宽度设置为0.2，得到15 批车前子及15 批炒车前子的HPLC 叠加指纹图谱和对照图谱。结果显示，15批车前子有18个共有峰，15批炒车前子有13个共有峰。经对比发现，车前子与炒车前子共有8个共有峰，即车前子指纹图谱中的峰1～峰3、峰6、峰13～峰16，炒车前子指纹图谱中的峰1～峰3、峰7、峰10～峰13（车前子中的峰6、峰13～峰16 分别与炒车前子中的峰7、峰10～峰13对应，为方便后文描述，将对应的共有峰依次标记为峰A～峰H）。15批车前子与15批炒车前子的HPLC叠加指纹图谱见图1，对照图谱见图2。

图1 15批车前子与15批炒车前子的HPLC叠加指纹图谱

图2 车前子与炒车前子的对照图谱

2.1.8 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》对15 批车前子及15 批炒车前子进行相似度评价。结果显示，30批样品与对照图谱的相似度均大于0.920，表明车前子炒制前后的化学成分种类相似。结果见表2。

表2 15批车前子与15批炒车前子的相似度评价结果

2.1.9 共有峰的指认 将车前子及炒车前子的对照图谱（图2）与对照品的色谱图（图3）进行比较，共指认了2个共有峰，分别为车前子中的峰6（京尼平苷酸）、峰13（毛蕊花糖苷），炒车前子中的峰7（京尼平苷酸）、峰10（毛蕊花糖苷）。由于京尼平苷酸的分离度较好，含量较高，邻近峰较少，易于区分，故选择京尼平苷酸为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，车前子中各共有峰相对保留时间的RSD 为0.08%～0.55%，相对峰面积的RSD为3.86%～44.09%；炒车前子中各共有峰相对保留时间的RSD 为0.08%～0.64%，相对峰面积的RSD 为12.51%～58.61%。各样品相对保留时间的RSD 差异较小，相对峰面积的RSD差异较大，表明同一品种、不同产地、不同批次车前子炒制前后所含化学成分的种类具有较高的相似度，但含量存在较大差异。

图3 京尼平苷酸与毛蕊花糖苷对照品的HPLC图

2.2 聚类分析

以15批车前子与15批炒车前子共有峰的峰面积为变量进行标准化处理，使用SPSS 25.0软件，采用质心聚类法，以平方欧氏距离为测度进行聚类分析。结果显示，当欧氏距离为5时，30批样品可聚为6类，其中S1为一类，S2～S5 为一类，S6～S15 为一类，S16～S17 为一类，S18～S20 为一类，S21～S30 为一类；当欧氏距离为10 时，30 批样品可聚为3 类，其中S1～S5 为一类，S6～S15、S21～S30为一类，S16～S20为一类；当欧氏距离为16 时，30 批样品可聚为2 类，S1～S5、S16～S20 为一类，S6～S15、S21～S30为一类。结果见图4。

图4 15批车前子与15批炒车前子的聚类分析树状图

2.3 主成分分析

以15批车前子与15批炒车前子共有峰的峰面积为变量，使用SPSS 25.0软件进行主成分分析。结果显示，前2 个主成分的累计方差贡献率为82.575%，表明前2个主成分可以反映样品的质量。通过碎石图可知，前2个主成分的曲线陡峭，后面6个主成分的曲线较平缓，表明前2个主成分在车前子及炒车前子中具有重要作用。结果见表3、图5。

图5 车前子与炒车前子的主成分分析碎石图

表3 8个共有峰的特征值及方差贡献率

主成分载荷的绝对值越大，表示主成分的变量代表性越大[12]。采用SPSS 25.0 软件进行主成分因子载荷矩阵。结果显示，峰A、峰C、峰E、峰F、峰H在主成分1上具有较高的载荷值，表明这5 个峰对主成分1 的影响较大；峰D、峰G在主成分2上具有较高的载荷值，表明这2个峰对主成分2 的影响较大；峰B 在主成分1、主成分2上的载荷值均不高，表明其对主成分1、主成分2的影响较小。结果见表4。

表4 车前子与炒车前子的主成分因子载荷矩阵

综合评分能够反映样品的整体质量，评分越高表明样品的整体质量越好[13]。采用方差贡献率计算15 批车前子与15批炒车前子的综合评分。使用SPSS 25.0软件得到主成分1（Z1）和主成分2（Z2）的评分分别为Z1＝0.445×峰A－0.326×峰B+0.347×峰C－0.165×峰D－0.433×峰E+0.418×峰F+0.266×峰G－0.339×峰H；Z2＝0.081×峰A－0.378×峰B+0.062×峰C+0.631×峰D+0.199×峰E－0.029×峰F+0.532×峰G+0.356×峰H。其中，峰A～峰H 为共有峰的峰面积，Z1、Z2的系数为主成分1、2的载荷值与特征值开平方的比值，按公式计算综合评分（Z），Z＝Z1×主成分1的方差贡献率+Z2×主成分2的方差贡献率。结果显示，车前子的综合评分均小于0，炒车前子的综合评分均大于0（S24样品除外），表明综合评分可以较好地区分车前子与炒车前子。结果见表5。

表5 15 批车前子与15 批炒车前子的综合评分结果及排序

2.4 正交偏最小二乘回归分析

以15批车前子与15批炒车前子共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA-P 14.1软件进行正交偏最小二乘回归分析。结果显示，车前子均位于得分图的左侧，炒车前子均位于得分图的右侧，二者能明显分开。模型累计解释能力参数R2X（cum）为0.991，R2Y（cum）为0.965，模型预测度Q2（cum）为0.942，均大于0.500，表明模型构建成功，预测能力较强，拟合度好[14]。结果见图6。

图6 15 批车前子与15 批炒车前子的正交偏最小二乘回归分析得分图

当变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值大于1 时，表示变量对整体的贡献较大[15]，故以VIP 值大于1 为标准，得到贡献相对较大的3个峰，分别为峰E（毛蕊花糖苷）、峰D（京尼平苷酸）、峰G，表明这3个峰对车前子与炒车前子的贡献较大，推测其可能是影响车前子与炒车前子质量差异的标志性成分。变量的点距离原点的距离越远，表示变量对模型的影响越大[16]。结果显示，峰E、峰D、峰G 对车前子与炒车前子的影响较大。结果见图7、图8。

图7 8个共有峰的VIP值

图8 15 批车前子与15 批炒车前子的正交偏最小二乘回归分析载荷图

3 讨论

本课题组前期分别对不同流动相（甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液）、不同流速（0.5、1.0 mL/min）、洗脱时间（35、45、55 min）、柱温（30、35 ℃）等进行考察。结果显示，采用本研究所用的色谱条件时，各色谱峰均能较好地分离，基线相对平稳。

指纹图谱结果显示，15批车前子有18个共有峰，炒车前子有13个共有峰，车前子与炒车前子共有8个共有峰，共指认了2 个共有峰，分别为车前子中的峰6（京尼平苷酸）、峰13（毛蕊花糖苷），炒车前子中的峰7（京尼平苷酸）、峰10（毛蕊花糖苷）。15批车前子与对照图谱的相似度均大于0.980，15 批炒车前子与对照图谱的相似度均大于0.920，相似度较高，表明不同产地车前子、炒车前子的化学成分种类相似，具有较好的一致性。

聚类分析结果显示，当欧氏距离为10时，30批样品可聚为3类，其中S1～S5为一类，S6～S15、S21～S30为一类，S16～S20 为一类；当欧氏距离为16 时，30 批样品可聚为2 类，S1～S5、S16～S20 为一类，S6～S15、S21～S30 为一类，表明江西省和山东省产车前子有一定的相似性，能与湖北省产车前子区分开。主成分分析结果显示，前2个主成分的累计方差贡献率为82.575%，车前子的综合评分均小于0，炒车前子的综合评分均大于0（S24 样品除外），表明炒车前子的整体质量较好。正交偏最小二乘回归分析结果显示，峰E（毛蕊花糖苷）、峰D（京尼平苷酸）和峰G 可能是影响车前子与炒车前子质量差异的标志性成分，其可能与地理环境、气候条件、种植模式、采收期等有关。

综上所述，本研究所建指纹图谱稳定、简便快速，结合化学模式识别分析可用于评价车前子与炒车前子的质量。毛蕊花糖苷、京尼平苷酸和峰G所代表的成分可能是影响车前子与炒车前子质量差异的标志性成分。