朱晓富，卢圣鄂，卓 维，刘 艳，辛元尧，黄红燕，任风鸣

（重庆市药物种植研究所，重庆市南川区 408435）

牛至（Origanum vulgareL.）又名止痢草、小叶薄荷等，是唇形科（Lamiaceae）牛至属（Origanum）多年生草本植物［1］，收载于《中国药典》1977年版和《湖南中药》1993 年版［2］。在我国，牛至野生分布十分广泛，西南、长江沿岸地区、西北、华北等地均有分布［1，3-4］；路旁、山坡、林下及草地，海拔500～3 600 m皆可生长［4］。它具有清热解表、利水消肿的功效，主治感冒、头痛、急性胃肠炎、中暑、腹痛以及水肿等症［5-7］。

牛至中的成分主要为挥发性成分，其芳香精油因具很好的抗菌作用而被广泛研究［8-9］。非挥发性成分，如酚、黄酮、三萜、甾体和其他化合物则很少被研究［10-13］。牛至产地不同精油含量差异显著［15-16］。牛至精油成分以香荆芥酚和麝香草酚为主，是一种天然、环保且安全的理想抗生素替代品［5，17］。

本课题组于2020 年对云南省和四川省产地牛至中香荆芥酚、麝香草酚含量的测定和主要活性成分差异进行了分析，为今后牛至产地的选择和评价提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试验仪器

Waters2695 高效液相色谱仪（沃特世公司）；GCMS-QP2010气质联用仪（日本岛津）；GS-100A超声波提取器（深圳市歌能清洗设备有限公司）；WondaSil-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm × 5 μm），（日本岛津）；BP121S 型电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；GZX-9246MBE 电热鼓风干燥箱（上海博迅有限公司医疗设备厂）；XS-D4A 高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；HH-S4 数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

1.1.2 材料与试剂

牛至样品分别采自于云南省、四川省，采集时间为2020 年8 月，经重庆市药物种植研究所刘正宇研究员鉴定为唇形科植物牛至（Origanum vulgareL.）的干燥地上部分，10 个产地结果见表1，分别用L1-L10 表示。香荆芥酚（CAS：499-75-2，纯度≥98%）、麝香草酚（CAS：89-83-8，纯度≥98%）均购自于四川省维克奇生物科技有限公司。

表1 10个不同产地牛至的样品Tab.1 10 samples from different oregano

1.2 方法

1.2.1 HPLC测定香荆芥酚、麝香草酚含量方法1.2.1.1 HPLC 分析条件：色谱柱：WondaSil-C18 色谱柱（4.6 mm × 250 mm × 5 μm）；流动相：（甲醇25%，乙腈25%，水50%）；流速（1 mL·min-1），柱温（30℃）；进样量（20 μL）；波长（276 nm），参考文献刘红兵［3］。1.2.1.2 对照品溶液：称取香荆芥酚和麝香草酚标准品，置于容量瓶中，甲醇定容，得到香荆芥酚质量浓度0.018 7 mg·mL-1、麝香草酚质量浓度0.014 4 mg·mL-1的对照品溶液。

1.2.1.3 供试品溶液的制备：精密称量牛至样品细粉约1.0 g，置三角瓶中，甲醇溶液25 mL 浸泡，超声处理45 min，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

1.2.2 HPLC 测定香荆芥酚、麝香草酚含量方法学考察

1.2.2.1 精密度检查：以（1.2.1.2）方法制备出的对照溶液，重复5次，记录峰面积，计算香荆芥酚、麝香草酚的RSD结果。

1.2.2.2 重现性检查：选择含香荆芥酚0.211%，麝香草酚0.341%的牛至样品，采用（1.2.1.3）方法制备供试品，每次20 uL 进样，记录峰面积，计算香荆芥酚、麝香草酚的RSD结果。

1.2.2.3 稳定性检查：采用（1.2.1.3）方法制备供试品，分别在0 h，3 h，6 h，12 h，18 h，24 h 范围内进行试验，每次20 uL 进样，记录峰面积，计算香荆芥酚、麝香草酚的RSD结果。

1.2.2.4 加样回收率实验：选择已知含量的枳壳药材1.0 g，采用（1.2.1.3）方法制备供试品，准确添加适量香荆芥酚、麝香草酚，记录峰面积，计算香荆芥酚、麝香草酚的平均回收率和RSD结果［16-18］。

1.2.2.5 线 性关系考察：本方法参照文献［16-18］，以（1.2.1.2）方法制备出的对照溶液0.5 μL，1 μL，2 μL，4 μL，8 μL，16 μL，24 μL 范围内进样测定，以峰面积对对照品的进样量做工作曲线，得回归方程。

1.2.3 GC-MS分析牛至中成分

1.2.3.1 GC-MS分析条件：GC-MS2010气相色谱质谱联用仪（日本岛津），石英毛细管柱（Rtx-5MS，30 m×0.25 mm），柱初温（40℃），保持（2 min），升温速率（5℃·min-1），柱终温（200℃），保持（15 min），载气（He），分流比（50∶1），进样量（2 μL）。MS 条件：离子源（EI），电子能量（70 eV），扫描范围（45～600 m/z），离子源温度（230℃），接口温度（260℃），本方法参照文献［22-23］。

1.2.3.2 GC-MS 牛至样品溶液制备：准确称取牛至粉末约1.0 g，加入10 mL 甲醇，超声波45 min，通过0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.2.4 统计方法

统计学方法所有数据采用SPSS21.0 和Excel 统计学软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 牛至含量测定HPLC方法学考察结果

通过方法学考察确定仪器精密度、重复性均良好，样品处理后24 h 内吸光度较稳定，且加样回收率较理想，线性关系考察结果表明香荆芥酚进样量在0.000 9～0.448 8 μg 范围时和麝香草酚进样量在0.007 2～0.345 6 μg 范围时呈现良好的线性关系。说明采用HPLC 法可适用于牛至中的香荆芥酚以及麝香草酚含量测定。

表2 HPLC方法学考察结果（n=6）Tab.2 Investigation results of HPLC methodology（n=6）

2.2 牛至中香荆芥酚、麝香草酚含量HPLC 测定结果

在我国，牛至中香荆芥酚和麝香草酚的含量因产地不同差异显著。在牛至中香荆芥酚含量上，昆明、大理、丽江部分产地的含量较高；在牛至中麝香草酚含量上，大理、丽江和四川部分地区的含量高。昆明西山猫猫菁和昆明长虫山两个产地的牛至中麝香草酚含量较低，低于1%。大理产地的牛至中香荆芥酚含量较低，在1.5%左右。在牛至中香荆芥酚和麝香草酚总量上，大理、丽江采摘的牛至中两种化合物总含量相对高些，品质相对好些。HPLC 色谱图见图1，不同牛至样品中麝香草酚以及香荆芥酚的含量见表3。

表3 样品来源及测定结果（n=3）Tab.3 Sample sources and measurement results（n=3）

图1 牛至对照品（A）、牛至样品（B）HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of oregano reference substance（A）and oregano sample（B）

2.3 GC-MS分析不同产地牛至成分

样品GC-MS谱图中，依次对物质含量高且峰型完整的色谱峰积分，对所积分色谱峰开始质谱扫描，质谱数据系统检索（质谱数据库NIST08s.LIB），参考已发表的相关文献来确定相关化合物的名称，综合分鉴定出牛至中21种主要成分，采用峰面积归一化法测定牛至中化学成分相对含量。综合比较、评价不同产地牛至化学成分的差异。GC-MS 色谱图见图2，结果见表4。

图2 牛至的GC-MS色谱图Fig.2 GC-MS chromatogram of oregano

从表4 数据分析可得，10 个产地牛至成分结果对比，所含成分种类相同，主要基本成分一致，综合分析鉴定出21种主要相同成分。

表4 不同产地牛至化学成分分析结果Tab.4 Chemical composition analysis results of oregano from different origins

在牛至21 种成分中，香荆芥酚含量占15%～34%，其中L1、L2、L3、L7 中的香荆芥酚相对于其他产地较高，含量在30%以上，含量分别为30.22%、32.28%、33.28%、34.18%，而L8、L9 相对于其他产地最低，含量为13.58%、15.36%；麝香草酚含量在牛至21 种成分中占15%～42%，其中L3、L5、L7 中的麝香草酚相对于其他产地较高，含量在32%以上，含量分别为32.30%、42.27%、35.34%，而L1、L2 相对于其他产地最低，含量为20.12%、15.11%；邻伞花烃含量相对较低，在牛至21 种成分中占0.35%～1.6%，其中L6 含量1.69%、L7 含量0.91%相对较高。石竹烯也是牛至草的主要成分，含量在牛至21种成分中占2%左右。此外，牛至中还有γ-松油烯、石竹烯、大牛儿烯D以及γ-榄香烯。

除主要成分之外，牛至中还检测到了含量很高的焦儿茶酚，含量在13%～28%，其中L2、L8 相对于其他产地含量较高，含量分别为28.23%、25.17%，而L6、L7 相对于其他产地含量较低，含量分别为13.18%、12.71%。另外，本实验同时检测到牛至中含有少量的叶绿醇和植物醇。

3 讨论与结论

牛至精油中含有芳香类、萜类以及鞣酸等多种成分。药理研究表明，其具有抗菌抗氧化等活性［24-28］。文献报道，牛至中含有香荆芥酚和麝香草酚，且含量较高。香荆芥酚是牛至中主要的药用成分，因此它成为了被研究最多的精油成分之一，由于香荆芥酚的抗菌能力，牛至常被用来缓解动物肠道疾病［29-31］。麝香草酚也是存在于牛至精油中一种抗菌物质，单独使用或与香荆芥酚一起使用时具有很强的抗菌作用［29-31］。牛至中的香荆芥酚和麝香草酚两个化合物结构相似，互为同分异构体，并在牛至中存在一定的转换关系［19］。通过一次性测定不同产地牛至中香荆芥酚与麝香草酚含量，可以更客观地评价牛至质量。

本研究建立了HPLC 法测定牛至中香荆芥酚和麝香草酚含量的方法。在液相色谱图中，对照品均与所对应样品出峰的保留时间保持一致，可作为牛至质量控制的方法。同时，对10个不同产地的牛至进行了含量测定。结果表明，牛至中香荆芥酚和麝香草酚的含量因产地不同具有一定的差异。在牛至中香荆芥酚含量上，昆明、大理、丽江等地的含量较高；在牛至中麝香草酚含量上，大理、丽江和四川等地的含量高。综合分析，大理、丽江等地牛至中香荆芥酚与麝香草酚总量较高，品质较好。同时，不同海拔高度地区产的牛至，其中有效成分含量也差异显著，通常牛至在海拔较高的产地有效成分含量相对较低［32］。

通过比较不同产地的牛至中香荆芥酚和麝香草酚的含量，发现不同产地存在较大的差异。因此，本实验选取昆明、大理、丽江、四川产地牛至，利用GC-MS 分析鉴定出了牛至中的21 种主要相同成分，依次为：烯类、醇类、醚类、酚酸类、醛酮醌类、酯类及烷烃类等化合物。在这些成分中，含量较高的成分有香荆芥酚含量占15%～34%，麝香草酚含量占15%～42%，焦儿茶酚含量在13%～28%，叶绿醇含量占6.5%～8.3%，邻伞花烃含量占0.35%～1.6%，石竹烯含量占2%左右。与前期报道牛至中含有香芹酚、百里香酚和β-石竹烯等成分接近［33］。但由于所采用的方法不同，鉴定成分的种类、数量以及含量具有较大差异。

通过比较10个产地的牛至提取物的化学成分，各个产地化学成分一致，都鉴定得到了21种化学成分。但通过比较不同产地的牛至成分相对含量，发现存在较大的差异，说明牛至的资源品质参差不齐，可能由于产地环境的不同、气候的不同、基因的差异等多种因素共同影响。来自四川的3个产地的牛至化学成分差异较小，资源相近；云南省中不同产地牛至成分差异同样较大；来自大理、丽江的4个产地的挥发油成分含量相对较高，质量较好；来自昆明的相对小些。综上所述，本实验分析评价了我国不同产地牛至的主要活性成分差异，为今后牛至的产地选择和鉴别提供科学依据和参考。