甘瑞卿，何燕富,2*，李永成,2*，李来好，赵京菁，申铉日,2，李川,2

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南海口 570100）

（2.南海海洋资源利用国家重点实验室，海南海口 570100）

（3.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东广州 510300）

近年来，消费者对保健食品的需求日益增长，特别是高蛋白食品[1]。水产品加工工业每年产生许多副产物，其中鱼类在加工过程中产生的副产物包括鱼头、鱼鳞、鱼皮和内脏等副产物。这些副产物大约占据了整条鱼体的40%[2,3]。虽然这些副产物含有潜在生物活性特性的蛋白质和一些其他必需营养素，对它们的合理开发利用将为人类提供丰富的优质蛋白质资源[4]，但是这些副产物少部分制成肥料、饲料等[5]，大部分主要作为废弃物。因此充分利用这些鱼类副产物，对于更好的利用水产资源、提高水产鱼类加工的附加值和减少加工污染物排放均具有重要的现实意义。

蛋白酶水解可以从不同的样品中提取蛋白质和多肽。这种方法不仅简单有效、可控制，而且不会产生有毒有害的物质[6]，并且在蛋白水解过程中会产生各种滋味活性物质，使蛋白酶解液具有各种各样的滋味。滋味是由非挥发性的物质构成的，是鱼类产品整体风味的重要的组成部分，好的滋味能为消费者带来强烈的消费欲望。不同来源的鱼副产物、不同的酶制剂和不同的水解条件下获得的鱼蛋白水解物的组分存在差异，因为不同的酶制剂在对蛋白质具有不同的酶切位点，产生不同长度和结构的多肽，因此滋味也存在差异。Yang 等[7]利用复合蛋白酶水解Takifugu obscurus副产物获得具有强烈鲜味的多肽，而Fu 等[8]利用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解牛肌肉得到具有苦味的多肽。过去十年多年，关于呈味的氨基酸类物质的研究较多，特别是禽畜肉类上，但对于酶促蛋白质水解后产生的非挥发性关键肽及其贡献蛋白水解产品的典型味道特征的研究相当零碎。

将多肽组学工具与感官分析结合起来可能是一种很有前景的研究策略，利用这种方法可以监测蛋白酶解过程中关键滋味物质的演化，从而阐明蛋白水解物中的鲜味、苦味和其他异味物质的来源。本实验以罗非鱼鱼皮、鱼头和鱼骨为原料，比较探究中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶6 种蛋白酶的水解特性，并应用多肽组学来研究滋味活性肽的来源，为改善鱼副产物水解物的滋味提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼（Oreochromis niloticus）副产物（鱼头、鱼皮和鱼骨）获取于海口市沿江市场。

中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶河南圣斯德实业有限公司。所使用的蛋白酶均为食品级。

盐酸、氢氧化钠、乙醇西陇化工股份有限公司；乙腈、三氟乙酸均为色谱级上海安普实验科技股份有限公司；L-亮氨酸上海源叶生物科技有限公司；N-乙酰-l-半胱氨酸（163.19 u），尿苷（224.2 u），抑肽酶（6512 u），细胞色素（12500 u）和肌红蛋白（17600 u）标准品上海阿拉丁生化科技股份有限公司；邻苯二甲醛混合液（50 mmol/L 邻苯二甲醛（OPA）、50 mmol/L N-乙酰半胱氨酸、20%十二烷基硫酸钠、0.1 mol/L 无水四硼酸钠以体积比2:2:1:15 避光混合并搅拌1 h 后使用）本实验室自制。

1.2 仪器与设备

高速组织捣碎机，美国waring 商业公司；手持均质机，上海净信实业发展有限公司；MP511 型实验室pH 计，上海三信仪器有限公司；水浴恒温振荡器，常州金坛精达仪器制造有限公司；多功能微孔板检测仪，美国伯腾仪器有限公司；TGL-16M 台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；LC-MS/MS，赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 罗非鱼副产物前处理

将三种副产物分别清洗，置于沸水中煮15 min，灭内源酶活；再进行搅碎、分装，置于-20±2 ℃贮藏，待进一步实验。

1.3.2 罗非鱼副产物蛋白酶解液的制备

在酶解前，分别取适量的三种罗非鱼副产物置于4 ℃冰箱解冻。按固液比1:3（g/mL）加水，冰浴匀浆（8000 r/min，3×30 s），将匀浆好的样品用1 mol/L 的NaOH 或HCl 溶液调pH 值至各蛋白酶的最适pH 值，在恒温水浴震荡摇床中调温度至各蛋白酶的最适温度，分别按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的酶添加量加入不同副产物中，选出各种副产物中不同蛋白酶中的最佳酶添加量后，以最佳的酶添加量制备不同副产物蛋白酶解液，酶解完毕后于100 ℃水浴煮10 min 灭酶，冷却到室温，在6000 r/min，4 ℃下离心15 min，收集上清液备用。根据表1 的蛋白酶最适酶解条件，按相同操作制备出相应的蛋白酶解液。

表1 各种蛋白酶的最适酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions of each enzyme

1.3.3 水解度的测定

1.3.3.1 标准曲线的绘制

取24 支试管分三组，分别加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16、0.24 mL 5 mg/mL 的L-亮氨酸标准溶液，用水补足到1 mL，然后从各个浓度分别取10 μL 于棕色离心管中，分别向其中加入1.2 mL OPA 混合液，震荡摇匀，静置10 min 后，于340 nm处测定吸光度。用未加L-亮氨酸标准溶液的第1 支试管作为空白对照。取三组测定的平均值，以L-亮氨酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3.2 氨基的测定

取10 mL 酶解液加入1.2 mL 的OPA 混合液，避光静置10 min 后，在波长为340 nm 处测定其吸光值。总氨基含量是利用6 mol/L HCl 水解蛋白样品后测定的。按照下式计算水解度：

式中：

(NH2)x——样品水解后的氨基含量，mg/mL；

(NH2)0——样品未水解前的自由氨基含量，mg/mL；

(NH2)总——样品含有的总氨基含量，mg/mL。

1.3.4 肽分子量分布

利用尺寸排阻色谱测定肽分子量的分布。检测条件：Agilent 高效液相色谱仪，BioSepSEC-S2000 色谱柱（300×4.6 mm；Phenomenex，USA），洗脱液为20%乙腈水溶液加入0.1%三氟乙酸，流速0.35 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为214 nm。分子质量校正曲线所用标准品为N-乙酰-l-半胱氨酸（163.19 u），尿苷（224.2 u），抑肽酶（6512 u），细胞色素（12500 u）和肌红蛋白（17600 u），校正曲线方程为：

式中：

Mw——分子量，u；

t——洗脱时间，min。

1.3.5 感官评价

感官评价根据Fu 等[8]提出的方法略作修改。感官评价小组由经过筛选和专业培训的年龄介于20～25 岁之间的8 名感官评价员所组成，4 名男性，4 名女性。分别以100 mg/mL 咖啡因、100 mg/mL 谷氨酸钠、50 mg/mL 乳酸和50 mg/mL 氯化钠作为苦味、鲜味、酸味和咸味四种味觉参比液，对评价员提前两个月进行感官训练。在室温（25±1 ℃）条件下，采用九分法来评价每种酶解液的苦味、鲜味、酸味和咸味，0～3 表示弱、4～6 表示标准和7～9 表示强烈。

1.3.6 LC-MS/MS

1.3.6.1 LC-MS/MS 检测

每个样品取1 μL 总肽经nano-UPLC 液相系统EASY-nLC1200 进行分离后联用配备纳升离子源的质谱仪（Q-Exactive HFX）进行数据采集。色谱分离采用100 μm ID×15 cm 反相色谱柱（Reprosil-Pur 120 C18-AQ，1.9 μL，Dr.Math）进行。流动相采用乙腈-水-甲酸体系，其中流动相A 为0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈为2%），B 相为0.1%甲酸-80%乙腈溶液（水为20%）。色谱柱以100%的A 相平衡后，样品由自动进样器直接上样到色谱柱，再经色谱柱梯度分离，流速300 nL/min，梯度时长120 min。流动相B 比例：2%～5%持续2 min，5%～22%持续88 min，22%～45%持续26 min，45%～95%持续2 min，95%持续2 min。质谱分析使用数据依赖性采集模式，总分析时长为120 min，采取正离子检测模式。一级扫描范围350～1600m/z，分辨率为120 k（@ 200m/z），AGC为3e6，最大离子注入时间（max IT）为50 ms；一级扫描中强度最高的20 个离子经四极杆筛选后使用HCD 裂解后进行碎片离子扫描。四极杆隔离窗口为1.2m/z，标准化碰撞能为27%，AGC 为1e5，max IT为110 ms。二级扫描分辨率15 k。根据色谱峰峰宽，动态排除时间设为45 s；单电荷及＞6 价的离子不进行二级扫描[9]。

1.3.6.2 搜库鉴定和蛋白定量

原始数据文件首先使用ProteoWizard（version 3.0.18299）软件转换为mzML 通用文件格式。质谱谱图数据使用MSFragger3 软件与对应物种水平的数据库序列（uniprot-Oreochromis+Niloticus-8128-2020-10.fasta）进行搜库匹配，主要搜库参数采用官方推荐值（详见philosopher.yaml）。酶切特异性设为：non-specific；允许多肽长度范围：7～25；可变修饰包括：15.994915[M]，42.010565[n-term]；[C]无烷基化修饰；母离子质量精度：+/-20×10-6；碎片离子精度：+/-20 ppm。MSFragger 搜库结果随后使用Philosopher（v3.3.11）[10]工具集进行后续分析，主要包括PeptideProphet（v5.2.1）用于多肽FDR（1%）控制，ProteinProphet（v5.2.1）用于蛋白FDR（1%）控制，freequant 用于多肽（蛋白）定量分析，IonQuant[11]用于蛋白maxLFQ 定量，最小允许1 对离子比值。

1.4 数据统计分析

数据采用SPSS 23.0 进行相关数据的方差分析和显著性检验，每组实验重复3 次取平均值，采用Origin 2019b 和GraphPad Prism 8.0 制图；PCA 双曲线图由SIMCA 14.1 绘制，从国际蛋白资源库（https://www.uniprot.org）中获得尼罗罗非鱼参考蛋白质组。

2 结果与分析

2.1 水解度

OPA 法测定多肽含量的原理是利用氨基与苯二醛之间在340 nm 的波长下发生荧光反应[12]。六种不同蛋白酶对罗非鱼的鱼皮、鱼头和鱼骨的水解程度随时间的变化曲线如图1 所示。由图可见，三种副产物均在风味蛋白酶的酶解作用下获得最高的水解度（p＜0.05），其中鱼皮为14.29%（图1a），鱼头为23.7%（图1b），鱼骨为31.86%（图1c）。根据作用机制和催化位点，蛋白酶分为内切酶和外切酶[13]。内切酶主要作用于肽链的中间位置，而外切酶则主要作用于肽链两端。风味蛋白酶同时含有内切和外切两种活性酶，作用位点多，酶解速率高于其他蛋白酶，同时产生较多的游离氨基酸也多于其他蛋白酶[14,15]，这可能解释了风味蛋白酶酶解物水解度显著高于其他蛋白酶的原因（图1）；其他五种蛋白酶均为内切酶，只作用于肽段中间，缺乏足够多的端点，而导致酶解物的水解度低。茼玉婷和丛艳君[16]在利用风味蛋白酶、木瓜蛋白酶等六种商业酶水解草鱼内脏蛋白的研究中，发现经过风味蛋白酶水解的酶解液中富含氨基酸；而Zahra等[17]采用碱性蛋白酶和风味酶对虹鳟皮进行水解，风味酶水解物得到较高的水解度，与罗非鱼副产物所得结果相一致。

2.2 感官评价

为了研究蛋白质水解物与感官属性之间的关系，进行了主成分分析（PCA）（图2）。罗非鱼鱼皮蛋白水解物的PCA 图表示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）贡献率分别为50.7%和47.1%（图2a）。经过中性蛋白酶处理的鱼皮蛋白水解液具有标准鲜味（3.88）和弱酸味（2.38），而经过木瓜蛋白酶处理的蛋白酶解液有标准苦味（4.36）。图2b 显示了罗非鱼鱼头蛋白水解度的主成分分析结果（PC1=65.5%和PC2=34%）。经过碱性蛋白酶处理的蛋白酶解液呈现标准鲜味（3.88），经过中性蛋白酶处理的蛋白酶解液有苦味（4.25）。如图2c 所示，罗非鱼鱼骨水解物的主成分分析结果显示，PC1 和PC2 的贡献率分别为53.8%和31.5%。菠萝蛋白酶处理的蛋白水解液的鲜味强度最高（6.88），木瓜蛋白酶处理的水解物有标准苦味（4.88）和弱酸味（2.0）。值得注意的是，木瓜蛋白酶在三种蛋白水解液中产生不良滋味（包括酸味和苦味），碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶分别在鱼头和鱼骨中产生了鲜味，而中性蛋白酶在鱼皮蛋白水解液中产生了鲜味，但在鱼头蛋白水解液却产生了苦味。

蛋白酶解液的感官属性与水解度有关，尤其与含有疏水氨基酸的低分子量肽的含量有关[13,18]。而这种低分子量肽的产生取决于所使用的酶和底物[19,20]。木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶均为巯基蛋白酶，这两者的区别在于木瓜蛋白酶的活性位点具有广泛的底物特异性，包括水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基末端，表明它可以释放苦味氨基酸，如精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸；而菠萝蛋白酶活性部位不具有特异性，这可能是木瓜蛋白酶产生酸苦味而菠萝蛋白酶水解的酶解液产生鲜味的原因。同一蛋白酶的不同结果可能是由于底物特异性[13]。Maehashi 等[20]曾报道，同一种酶可以在不同水解物中产生不同的味道。这与我们得出中性蛋白酶在不同样品中产生不同滋味的结果相同。

2.3 肽分子量分布

图3 为罗非鱼鱼皮、鱼头和鱼骨的肽分子量的分布。三种鱼副产物的肽分子量主要分布在1000～5000 u（60%）和500～1000 u（30%），这表明鱼副产物中的大部分蛋白质被水解成肽（图3a～c）。从图3a 可以看出，三种副产物中鱼皮产生较多的大分子肽，这可能是因为鱼皮中含有较多胶原蛋白，使之较难水解[21]。研究表明，苦味肽[22,23]和鲜味肽[8]等滋味肽主要来源于小分子肽。

三种副产物经过风味蛋白酶酶解的蛋白水解液中小于1000 u 的肽含量最多，这与水解度中风味蛋白酶获得最高的水解度的结果相符合。然而，在风味蛋白酶的水解液中，鲜味、酸味和苦味等滋味不突出。可以解释这个现象的原因有二：一是可能是因为鲜味、甜味或咸味等滋味对苦味有一定的掩盖作用，如鲜味肽可以通过苦味受体抑制苦味[24]，导致蛋白酶解液的滋味不显著；二是因为这些蛋白水解液中含有较少的滋味活性肽，使蛋白酶解液的滋味不突出。因此，对中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在鱼皮水解产生的滋味特性，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对鱼头水解的滋味特性，菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对鱼骨水解的滋味特性进行了进一步的探究。

2.4 潜在滋味活性肽的鉴定

图4表示采用LC-MS/MS鉴定从三种鱼副产物的酶解液中挑选出来具有不同滋味的蛋白酶解液中肽的组成。从鱼皮蛋白酶解中一共鉴定出5833 个肽，其中在具有鲜味和酸味的酶解液中鉴定出2106 个肽，而在具有苦味的酶解液中鉴定出3727 个肽；从鱼头蛋白酶解液中共鉴定出8952 个肽，其中具有鲜味的酶解液中鉴定出1828 个肽，具有酸味的酶解液中鉴定出3050个肽，具有苦味的酶解液中鉴定出4074 个肽；从鱼骨蛋白酶解液中共鉴定出6888 个肽，其中具有鲜味的酶解液中鉴定出2586 个肽，具有苦味和酸味的酶解液中鉴定出4074 个肽（图4a）。分别从这些鉴定出来的肽中筛选三种副产物中共有的肽为潜在的滋味肽，分别得到66 个潜在鲜味肽、271 个潜在酸味肽和308 个潜在苦味肽（图4b）。

如图4c 所示，潜在的鲜味肽的肽段长度主要集中在9～13 个氨基酸（68.18%）；潜在的酸味肽和苦味肽主要集中在10～14 个氨基酸（64.21%和60.06%）。肽段的结构和序列长度会影响其滋味特性，肽段序列长度越长对滋味的影响越大。先前有研究报道，鲜味肽（包括鲜味增强肽）的肽段长度主要集中在2～15 个氨基酸[25-27]，然而苦味肽主要集中在2～8 个氨基酸[22,28,29]。当苦味肽中含有8 个或8 个以上的氨基酸的苦味效果与8 个以下氨基酸构成的苦味肽相差不大

[30]。这些结果与以前的研究结果相一致。

滋味活性肽是一种与滋味有关的寡肽，其分子量小于3000 u[31]由图4d 可见，鉴定出来的潜在滋味活性肽的分子量均在3000 u 以下，而大部分的肽的分子量在1000～1500 u。潜在的鲜味肽的分子量范围小于1500 u，而潜在的苦味肽和酸味肽的分子量范围小于2000 u。据相关报道，鲜味肽的分子量均小于或等于1000 u[31,32]；然而，苦味肽与分子量之间的关系尚不明确[14,15]。Cheung[33]的研究表明虾酶解液中的肽在3000 u 时，苦味最大；同样有研究表明分子量在1900～3300 u 之间的肽是高苦肽段，而较大或较小分子量的肽段则表现出温和的苦度[34]。至于酸味肽，其分子量与滋味强度之间的关系尚不明确，仍需要进一步验证。

2.5 蛋白酶酶切特异性

利用LC-MS/MS 确定了三种潜在滋味肽的序列特异性。主要分析四个位置的酶切位点：N 端第二个氨基酸（P2’），N 端第一个氨基酸（P1’），C 端第一个氨基酸（P1），C 端第二个氨基酸（P2）。根据酶的特异性，不同的酶可以产生不同类型的肽[35]。通常认为肽段的C端处含有亲水性的氨基酸残基会产生较好的滋味，而含有疏水性的氨基酸如苯丙氨酸和缬氨酸会增加苦度[36]。在三种滋味活性肽中，P1 和P1’的位置主要均以异亮氨酸和丙氨酸为主（图5）。对比三种滋味活性肽的酶切位点可以发现，蛋氨酸出现在潜在滋味肽的频率高于其他两种。蛋氨酸作为含硫氨基酸虽然本身不会产生肉味，但对酶解液风味的形成具有重要作用[37]。图5a 表明，三种内肽酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶）在P1 和P1’处有对不带电荷的非支链残基有优先裂解作用，并且可以发现潜在苦味肽和酸味肽具有相似的酶切位点（图5b 和5c）。这与感官评价结果相一致。并且，三种潜在的滋味肽两端的氨基酸残基均为疏水性。多肽的苦味与肽中是否存在亲水性基团和碱性氨基酸残基有关，并认为亲水性基团与疏水性基团在空间相距0.3 nm 时便会产生苦味[34]。有报道鲜味肽中含有疏水性氨基酸，而这些疏水性氨基酸通常是与苦味肽有关的[38]。从文蛤中鉴定并合成的鲜味多肽和鲜味增强肽的肽段序列中含有较多疏水性氨基酸[27]；Ruan 等[39]从罗非鱼下颚中提取了五个鲜味肽，其氨基酸序列中多数为疏水性氨基酸。因此，罗非鱼副产物蛋白水解滋味肽可能与疏水性氨基酸有关，并且蛋氨酸可能在有鲜味的酶解液中起到重要作用。

2.6 前体蛋白

图6a 为鉴定的与潜在滋味活性肽相关的前体蛋白，图6b 表示潜在鲜味肽的前19 个前体蛋白，图6c和图6d 分别表示潜在酸味肽和苦味肽的前20 个前体蛋白。胶原蛋白和肌原纤维蛋白，特别是肌动蛋白、肌钙蛋白和肌球蛋白等是潜在滋味活性肽的主要来源蛋白。另外，肌浆蛋白，如2-磷酸-D-甘油酸水解酶和L-乳酸脱氢酶等同样对对滋味肽作出贡献（图6b～6d）。

先前有研究报道与滋味有关的氨基酸或者小肽可能是肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的水解产物[29,40]并且由肌钙蛋白T 产生的多肽可以促进牛肉味的产生[41]。然而，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的蛋白水解也会导致不良的滋味[42]。这说明肌浆蛋白和肌原纤维蛋白是蛋白酶解液中各种滋味的主要来源蛋白。在目前的实验中，发现滋味活性物质不仅来源于肌浆蛋白和肌原纤维蛋白，而且也有可能来源于胶原蛋白。但是胶原蛋白与滋味活性物质之间的关系还需要进一步探究。

3 结论

采用六种商业酶来水解罗非鱼三种副产物（鱼皮、鱼头和鱼骨）选出具有代表性滋味的酶解液，通过LC-MS/MS 分析罗非鱼副产物的滋味来源。结果表明鱼皮、鱼头和鱼骨分别经过风味蛋白酶酶解的水解度最高，分别为14.29%、23.7%和31.86%。鱼皮经过中性蛋白酶处理的酶解液具有显著鲜味和弱酸味，经过木瓜蛋白酶处理的酶解液具有苦味；鱼头经过碱性蛋白酶处理的酶解液具有显著鲜味，经过中性蛋白酶处理的具有苦味，经过木瓜蛋白酶处理的具有酸味；鱼骨经过菠萝蛋白酶处理的酶解液具有强显著鲜味，经过木瓜蛋白酶水解的具有显著苦味。罗非鱼副产物蛋白酶解液中潜在滋味肽主要是由胶原蛋白、肌浆蛋白和肌原纤维蛋白降解得到，其分子量小于1500 u，疏水性氨基酸在这些潜在滋味肽中起重要作用，其中蛋氨酸对鲜味酶解液作出重要贡献。