张铭铭，范起业，李文萃，王家鹏，唐小林

（中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016）

黄茶是我国六大茶类之一，但因受原料及工艺的限制，产量极低[1]。虽然近年来黄茶在地方政府的扶持下产量有所增加，但其发展也不如其他五大茶类[2]。因此，亟需开展黄茶系列研究，从生产加工、市场推广、营销渠道等多方面下足功夫，开拓黄茶市场，使其品质和功能在六大茶类中大放异彩[3]。

研究表明，γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）是重要的抑制性神经递质，具有显著的降血压功能[4,5]，也有安神助眠[6,7]、提高记忆力[8]等效果，对人体健康和保健具有积极作用。该种非蛋白质氨基酸在自然界中分布广泛，但在茶鲜叶中的含量较低，一般在40～50 mg/100 g 之间[9]。研究表明，植物体内合成与转化为GABA 的途径有两条[10,11]：一条是L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化脱羧而成，另一条是由多胺降解的中间产物转化而来。外界的胁迫作用（温度、压力、氧浓度、盐浓度）和机械损伤等刺激可促进植物体内GABA 的形成[12]。茶叶中GABA 含量达到150 mg/100 g 时称之为GABA 茶[9]，茶叶中常采用植物富集法和微生物富集法来积累GABA。其中，植物富集法主要是对茶树鲜叶进行厌氧处理[13]、浸泡处理、冷冻处理、红外线照射[14]等来激活谷氨酸脱羧酶，加速将谷氨酸或其盐脱羧转化成目标产物；微生物富集法是利用微生物（如酵母菌）体内的谷氨酸脱羧酶，促进茶叶应激代谢合成和积累GABA，如在制茶揉捻过程中加入乳酸菌发酵液以增加其含量[15]。以上方法大多基于鲜叶或离体鲜叶进行研究，仍需进行后续的加工处理，而且在推广使用上存在很多问题[16]：比如谷氨酸钠溶液处理鲜叶容易产生“水闷味”；厌氧处理对品质影响相对较低，但需要专用的生产设备（茶鲜叶厌氧处理机），氮气嫌气处理成本也较高；微波及红外线照射处理能耗大、生产成本过高；菌类处理技术较复杂且不够成熟等。

目前，多数研究集中于提升GABA 在绿茶、红茶[17]、乌龙茶[18]、白茶及超微茶粉和速溶茶粉[19]等茶类及茶制品中的含量，而关于高GABA 含量的黄茶研究少之又少[20]。本研究借助黄茶闷黄工序下的氧胁迫环境，着重考察闷黄方式、闷黄设施及闷黄条件对GABA 含量的影响，通过感官审评、GABA 含量测定结果来综合判定有利的闷黄技术参数。研究结果不仅有助于丰富GABA 在黄茶领域的研究理论体系，而且对高GABA 黄茶的生产有重要的借鉴意义。此外，该项研究为功能黄茶的开发探寻了一条新途径，对增加黄茶产品花色、开拓黄茶市场、促进企业提质增效具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 原料

分别于2020 年春、秋季和2021 年春季，采摘浙江省湖州市德清县的鸠坑品种鲜叶，嫩度等级以一芽二叶为主。

1.2 仪器与设备

YJY-EM-80 茶叶电磁杀青机，余姚市姚江源茶叶茶机有限公司；6CR-40 茶叶揉捻机，浙江绿峰机械有限公司；6CFJ-200 红茶发酵机，浙江绿峰机械有限公司；60 型竹编炭焙热源烘焙笼，浙江省德清莫干山黄芽茶业有限公司；6CHW-4 链板式茶叶烘干机，浙江绿峰机械有限公司；DL-6CH-6 型茶叶烘焙机，泉州得力农林机械有限公司；6CDY-10 茶叶多用机，安吉元丰茶叶机械有限公司；SOP 电子天平，赛多利斯仪器公司；TSQ Quantum Access Max 液相-质谱联用仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 加工工艺

（1）不同季节原料对GABA 含量的影响研究

以2020 年春、秋季鲜叶为原料，均按照干坯闷黄（摊放→杀青→揉捻→初干→闷黄→复干）的工艺流程加工，通过控制初干时间（干燥2、4、6 min）得到不同程度的干坯闷黄样品，进行系统性的比较实验。各工序参数保持一致：摊放（3 cm 厚，摊放12 h 至鲜叶萎软，含水率70%左右）、滚筒杀青（前/中/后段温度：270 ℃/245 ℃/156 ℃，投叶量120 kg/h，含水率48%左右）、揉捻（轻重轻原则，揉30 min）、初干（理条机转速1000 r/min，250 ℃）、闷黄（自然闷黄16 h）、复干（链板式烘干机110 ℃，10 min）。

（2）不同闷黄方式对GABA 含量的影响研究

以春季鲜叶为原料，设计4 种不同的闷黄方式进行研究，具体工艺流程见表1。相同工序统一技术参数，其中摊放、杀青、揉捻的工艺参数同1.3.1（1），干燥工艺采用链板式烘干机：初烘120 ℃，10～20 min，复烘110 ℃，至足干。针对初步实验结果，再以烘笼闷黄为研究对象，细化研究对比干坯闷黄和湿坯闷黄两种方式（见表2）。

表1 黄茶不同闷黄方式的工艺流程Table 1 Yellow tea process flow of different yellowing process methods

表2 干坯闷黄和湿坯闷黄方式比较实验设计Table 2 The design of the comparative experiment of dry and wet yellowing process

（3）闷黄设施及闷黄条件对GABA 含量的影响研究

以春季鲜叶为原料，按照湿坯闷黄（摊放→杀青→揉捻→闷黄→干燥）的工艺加工，闷黄工序外的其他工艺参数保持一致。摊放、杀青、揉捻的工艺参数同1.3.1（1），干燥工艺参数同1.3.1（2）。以不闷黄的茶样作对照组，不同闷黄设施及闷黄条件设计如表3 所示。

表3 不同闷黄设施及对应的闷黄条件Table 3 Different yellowing process facilities and corresponding conditions

1.3.2 感官审评由具有多年评茶经验的专家严格按照GB/T 23776-2018 审评，并按照品质加权法评分（总分=外形×25%+汤色×10%+香气×25%+滋味×30%+叶底×10%）。

1.3.3γ-氨基丁酸含量的检测分析

GABA含量按照GB/T 30987-2020的第三法-液相色谱-串联质谱法测定。液相色谱：HILIC 柱，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；以20 mmol/L 甲酸铵-水溶液为流动相A，20 mmol/L 甲酸铵-乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱（程序见表4）；流速0.5 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL；质谱条件：电喷雾离子化；正离子模式扫描；多反应监测法检测；喷雾电压3500 V；离子传输管温度350 ℃；鞘气10 arb；辅助气3 arb；吹扫气1 arb。游离氨基酸含量按照GB/T 8314-2013 测定。

表4 液相色谱-串联质谱法洗脱程序Table 4 Elution procedure by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

1.3.4 数据处理

标准偏差分析采用Microsoft office excel 2013 软件，显著性分析采用SAS 9.4 软件。

2 结果与分析

2.1 原料季节性对γ-氨基丁酸含量的影响

以同一品种、嫩度，不同季节（春、秋季）的鲜叶为原料，采用同一干坯闷黄工艺，改变初干的干燥时间分别进行闷黄以获得不同茶样，提升实验可靠性。由表5 可知，春季黄茶的GABA 含量均高于秋季黄茶，且均值高出15.16 mg/100 g；感官品质也显著优于秋季茶样，总体评分高出3 分左右。春季鲜叶内含物质丰富，游离氨基酸含量多（如L-谷氨酸），能为GABA 的形成提供较多的合成先质，故反映在成品茶中其氨基酸总量稍高于秋季茶样，这与前人的研究结果[21]相一致。

表5 不同季节原料对实验相关指标的影响Table 5 Effects of raw materials in different seasons on relevant experiment indexes

2.2 闷黄方式对γ-氨基丁酸含量的影响

以春季鲜叶为原料，设计4 种闷黄方式，每种闷黄方式下对应3 个不同样品进行探究，结果如表6 所示。GABA 的产生量与闷黄方式显著相关，表现为：湿坯闷黄＞干坯闷黄＞复合闷黄2＞复合闷黄1；感官品质也因闷黄方式不同而有所差异，表现为：湿坯闷黄＞复合闷黄2＞干坯闷黄＞复合闷黄1。总体而言，湿坯闷黄的GABA 产生量要显著高于其他三种方式，平均水平最高超出量达29.63 mg/100 g。整体感官品质也以湿坯闷黄方式为最佳，评分达到89.67，这与前人研究结果相似[22]。其次是复合闷黄2，感官品质显著优于复合闷黄1，这表明揉捻后闷黄效果优于杀青后闷黄。湿坯闷黄的茶叶含水率更高，一方面，水分是一切化学反应的介质，适宜的含水率能保证茶叶体内各类反应的正常进行；另一方面，高含水率与适宜温度构成的湿热环境可促使蛋白质水解成游离氨基酸[23]，从而有利于积累更多的GABA 合成先质。而揉捻后茶叶细胞破损率增加，谷氨酸脱羧酶与基质物质接触更加充分，比未揉捻直接闷黄更利于GABA 的形成反应，因此复合闷黄2 的茶样表现优于复合闷黄1。

表6 不同闷黄方式对GABA 含量及黄茶感官品质的影响Table 6 Effects of different yellowing process methods on GABA content and sensory quality

进一步地，选择GABA 生成量较高的干坯闷黄和湿坯闷黄方式，并且统一闷黄设施、闷黄温度及时间进行细化研究。结果表明，无论是GABA 的含量还是总体的感官品质，湿坯闷黄方式均优于干坯闷黄（见表7），且GABA 的含量差异达到了显著水平，也再次证实了上述结论的准确性。

表7 干坯闷黄和湿坯闷黄方式比较实验结果Table 7 Results of the comparative experiment of dry and wet yellowing process

综上，单一的湿坯闷黄与其他闷黄方式相比，能有效提升GABA 含量20～30 mg/100 g，这表明湿热作用对闷黄工序中GABA 的产生有重要影响，而该条件下茶坯含水率的适宜范围及微生物分泌胞外酶的有利温湿度条件均有待后续进一步研究。

2.3 闷黄设施及闷黄条件对γ-氨基丁酸含量的影响

由闷黄方式实验结果初步预判GABA 生成效果：机械闷黄＞烘笼闷黄＞自然闷黄（复合闷黄）。为进一步探究闷黄设施及闷黄条件对GABA 含量的影响，统一采用GABA 生成效果较好的湿坯闷黄方式进行试验。秋季进行的以机械闷黄为研究体系，固定闷黄时间，改变闷黄温度（30、40、50 ℃）来比较GABA含量的预实验结果表明，50 ℃下GABA 产生量最多，40 ℃下的黄茶品质最佳。可能是适度的高温增加了叶细胞的组织透性，为生成反应创造了有利条件。故本实验闷黄温度均采取50 ℃进行试验，结果如表8 所示。

表8 不同闷黄设施及闷黄条件对GABA 含量及黄茶感官品质的影响Table 8 Effects of yellowing process facilities and conditions on GABA content and sensory quality

经过闷黄处理的茶样GABA 含量要比不闷的高，增幅在12.38%～23.59%之间，说明厌氧处理（闷黄）能有效提高茶叶中GABA 的含量。由表可知，GABA含量变化也与闷黄设施及闷黄条件有关。整体而言，烘笼闷黄和发酵机闷黄的GABA 产量显著高于自然闷黄，两种设施间的GABA 产量差异不大，但感官品质以烘笼闷黄表现较佳。自然闷黄虽然感官品质较好，但GABA 产量却不高，可能厌氧环境及温度未在其形成的适宜范围。

就GABA 的产生效果而言，机械闷黄50 ℃，6 h的条件下，GABA 值达到了127.54 mg/100 g，显著高于该设施条件下其他处理，且远高于其他设施样品中的含量值，感官品质得分89.63；烘笼闷黄50 ℃，3 h的条件下，GABA 的产量次高，为119.04 mg/100 g，且感官品质达到90 分以上。此外，烘笼闷黄和机械闷黄在50 ℃，4 h 的条件下，GABA 含量均超过117.50 mg/100 g，感官品质也超过90 分，这表明该条件下较有利于GABA 形成。综合考虑黄茶的功能成分、感官品质及生产效率，烘笼闷黄（50 ℃，3 h/4 h）、机械闷黄（50 ℃，4 h）的技术参数可应用于实际生产。

值得注意的是，烘笼闷黄下GABA 的含量在2～7 h 内整体呈现先增后减趋势，在3 h 时达到峰值，而机械闷黄下GABA 的变化规律则表现为“双峰型”，6 h时出现第二次峰值，且为最大值。在闷黄初期，蛋白质发生水解和热解作用使游离氨基酸含量增加，但随着闷黄时间的延长，氨基酸本身发生的一系列热化学反应逐渐加强导致含量下降，故GABA 出现先增后减的现象[24]。杀青后氧化酶类虽然失去活性，但是机械闷黄的湿热环境可能比烘笼更易使微生物繁衍分泌胞外酶，导致相关反应基质增加[25]，从而导致6 h 时GABA 含量再次增加，具体原因还有待设计机理性实验进行研究。

3 结论与讨论

3.1 结论

原料和加工工艺都会影响茶叶中GABA 的形成。春季原料含有更多的GABA 合成先质，故成品茶中的GABA 含量水平比秋茶高出15.16 mg/100 g。闷黄工序给GABA 提供了天然的厌氧环境，能有效增加茶叶中GABA 的含量，未经闷黄的茶样与闷黄处理的茶样相比，GABA 含量最高可提升34.29 mg/100 g，增幅12.38%～23.59%。基于闷黄工艺技术研究结果，闷黄方式、闷黄设施及闷黄条件对GABA 的含量均有影响。就GABA 提升效果而言，湿坯闷黄显著优于干坯闷黄和复合闷黄（平均水平最高超出29.63 mg/100 g）；烘笼闷黄、机械闷黄优于自然闷黄（均值高出10.20 mg/100 g 以上）；50 ℃、4 h 的闷黄条件有利于GABA大量形成（生成量在106.95～117.60 mg/100 g 范围内）。

研究最终得出一套利于GABA 含量提升的闷黄工艺参数：以春季鲜叶为原料，采用湿坯闷黄，在发酵机50 ℃下闷黄6 h 条件下，GABA 含量可达到127.54 mg/100 g。而烘笼50 ℃下闷黄3 h，GABA 含量达119.04 mg/100 g，且感官得分超过90 分，该项闷黄工艺技术兼顾功能成分含量及品质提升效果，且时间较短，可用于指导生产实践。

3.2 讨论

多数研究表明厌氧处理能有效提高茶叶中GABA的含量，故前人多采用此法对离体鲜叶进行厌氧处理以获得GABA 茶[26]。但该种方法通常需要额外的厌氧设备及后续的加工处理，且通常会带来“水闷味”的品质问题。本研究利用闷黄工艺本身的厌氧富集优势，能有效解决这一问题，而且将其他茶类“叶片发黄”的品质劣势转变为黄茶的品质优势。

虽然春季原料能有效提升GABA 含量（均值：春季75.45 mg/100 g＞秋季60.29 mg/100 g），但由于该实验中采用的是自然闷黄方式，仍有一定供氧量，并且处于常温和低含水率的闷黄状态，其含量反而不及湿坯闷黄实验中对照处理（93.25 mg/100 g）。由此推测，除了含氧量，闷黄温度、茶坯水分（干坯/湿坯闷黄方式）等因素对闷黄工序中GABA 的产生也有影响。闷黄温度可能会影响谷氨酸脱羧酶的反应活性，茶坯含水率可能会影响杀青后微生物分泌胞外酶的环境条件，通过影响酶的产生而影响GABA 的形成，这些都有待机理性实验的进一步验证。再结合湿坯闷黄方式下不同设施处理的GABA 产生效果分析，自然闷黄（部分隔绝氧气、干坯状态）＜不闷黄（完全接触氧气、湿坯状态）＜自然闷黄（部分隔绝氧气、湿坯状态）＜烘笼闷黄（部分隔绝氧气、高温、湿坯状态）、机械闷黄（隔绝氧气、高温、湿坯状态）。这进一步表明除了鲜叶原料，闷黄环境、闷黄工艺及茶坯状态对GABA 的产生均有重要影响。值得说明的是：本研究中GABA的含量提升效果还达不到GABA茶的标准，但却比正常鲜叶含量高出3 倍之多，为GABA 黄茶加工开拓了一种新的思路。

本研究仅为初探性实验，全面但不够细致，有待后续设计系统性实验进行深入研究。比如基于现有的闷黄工艺及因子研究结果，加设外源处理因子（充不同的惰性气体、红外灯照射灯）来协同GABA 的形成反应，将更有效地提高黄茶中GABA 的含量；细化干燥工艺研究，可探究初干、复干温度的高低组合形式对GABA 保留率的影响；选取同一季节不同品种的鲜叶，对比其本身L-谷氨酸含量与经过闷黄处理后提升情况，可以找出GABA 茶叶的优势品种等。此外，目前有关GABA 在茶树中的形成机理尚不够清晰，基于闷黄工序喷施谷氨酸、谷氨酸钠溶液等有助于挖掘其形成机理。总之，本研究对后续GABA 机理系列研究、GABA 黄茶工艺研究等奠定了重要基础，对黄茶生产实践也有实际应用和参考价值。