周泳臣，刘颖，郑文忠，高峻*，赵一明，茶凤官，丁海琴，孔胜，吕才有

（1.云南农业大学茶学院，云南昆明 650201）

（2.云南省现代农业茶叶产业体系建设栽培研究室，云南昆明650201）

（3.普洱茶树良种场，云南普洱 665000）

四千多年前，中国就有了关于茶的记载[1]。目前茶树已在世界范围内普遍栽培，茶每日消耗量巨大，水是第一大饮料，而茶是第二大饮料[2]。茶中富含大量可溶性物质[3]，有茶氨酸、茶多酚、儿茶素、咖啡碱、有机酸和维生素等。茶有非常多的好处[4]，如抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化和降低胆固醇等。近年来，越来越多的人开始关心茶叶的品质[5]。影响茶叶品质的主要因素有茶叶的内含物、采摘季节、加工工艺和储存方式[6]等，其中与茶叶品种的内含物关系最为密切。基于此，鉴定出不同品种的茶叶内含物对于其品质的控制极其重要。

代谢组学是一种新起的技术手段[7]，目前，代谢组学的研究范围覆盖细胞代谢组学、药物代谢组学、代谢性疾病的代谢组学、植物代谢组学领域[8]。代谢组学能够更有效、更直观、更准确、更系统地反映生物体在不同生态条件下的变化，在研发新药[9]、诊断疾病[10]、分析转基因作物[11]、食品安全[12]等领域具有广泛的应用。代谢组学研究就是分析生物样品中的代谢产物，并鉴定和筛选出具有研究价值的显著差异代谢物，最后解释这些差异物的代谢过程和机制[13]。在茶叶中，代谢组学技术广泛应用于茶树栽培、品种分类鉴别、茶叶加工工艺优化、茶叶品质控制、茶叶年份及品质鉴别等[14]方面，对茶园土壤管理、茶树育种的改良、提高茶树抗逆性和嫁接砧穗的选择等有着积极的作用。

在中国云南省普洱市普洱良种场，实验人员通过群体选育的方式获得了两个当地的普洱茶优良品种，这两个茶品种有着较高的经济效益和生态效益，适应性较强，有一定的推广价值，所具备的特点在普洱茶树品种中具有一定的代表性。鉴于此，本研究利用代谢组学技术分析这两个普洱茶品种的代谢差异，旨在为茶叶适制性和品质控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

茶叶样品于2020年9月底在中国云南省普洱市普洱良种场的茶园采摘，均为枝条上一芽二叶的嫩芽，采后立即用液氮冷冻保存在-80 ℃环境中，直到进一步实验再取出进行研究。本次共采了两个样品，对应编号分别为B1 和B3，B1 代表品种1（桃形叶），B3代表品种3（云瑰），每个样品有3 个重复。为了探索代谢物在不同样本的差异，各样品分组以及对应信息在表1 种列出。

表1 样品信息及编号Table 1 Sample information and numbers

品种1（桃形叶）：又名木兰1 号、云桃。在云南大叶种茶树群体中通过系统选育技术得到的优良品种，无性系，乔木型，中叶类，迟生种。在普洱和西双版纳等地有大量试种成功，且在国内其他茶区均有推广。春茶一芽二叶干样含茶多酚30.6%、水浸出物44.8%。该品种耐旱力较强，但抗病虫害能力一般，耐寒能力弱，且熟地适栽性差。

品种3（云瑰）：在云南大叶种茶树群体中通过系统选育技术得到的优良品种，无性系，植株高大，树姿开张，分枝角度大，低位分枝多，叶片稍上斜状着生，叶长椭圆形，叶色深绿，叶身稍内折，叶缘微波，叶尖渐尖，叶齿深而明显，叶色绿，叶背茸毛密集，芽肥壮。春茶一芽二叶蒸青样含茶多酚34.10%、儿茶素190.27 mg/g、咖啡碱4.25%、水浸出物48.61%。该品种抗逆性强，生熟地适栽性较好。

1.2 标准品与试剂

甲醇（色谱纯），Merck 品牌；乙腈（色谱纯），Merck 品牌；标准品（色谱纯），BioBioPha/Sigma-Aldrich 品牌。

1.3 实验流程

实验流程见图1。

1.4 样品提取流程

（1）生物样品放置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥；

（2）利用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；

（3）称取100 mg 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；

（4）每30 min 涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6 次，样本置于4 ℃冰箱过夜；

（5）离心（转速12000r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔滤膜（0.22 μm pore size）过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.5 色谱、质谱条件

本研究利用超高效液相色谱（UPLC）和串联质谱（MS/MS）对数据进行采集。

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流动相A：超纯水（加入0.1%的甲酸）；流动相B：乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度：0 min B 相比例为5%，直到9 min，B 相比例线性增加至95%，同时持续95% 1 min，10～11 min，B 相比例骤降至5%，直至14 min，一直保持在5%；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4 μL。

1.5.2 质谱条件

LIT 和三重四极杆（QQQ）扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3 软件（AB Sciex）控制运行正负两种离子模式。ESI 源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设置为50、60 和25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ 和LIT 模式下分别用10 和100 μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ 扫描使用MRM 模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。通过进一步的DP 和CE 优化，完成了各个MRM 离子对的DP 和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM 离子对。

1.6 代谢物定性定量原理

利用数据库MWDB（metware database），使用二级谱信息对化合物定性，在分析时过滤掉同位素信息，其中包括K+离子、Na+离子、NH4+离子的重叠信息，还有本身为其他更大分子量化合物的碎片分子的重叠信息。

本研究采用了三重四级杆质谱的多反应监测模式（MRM）对代谢物进行定量分析。MRM 模式中，四级杆先检测目标物的前体分子（母离子），再剔除掉与其他分子量物质对应的分子以初步排除干扰;而前体分子在经碰撞室的诱导电离后断裂产生了很多碎片离子碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精准，获得更好的重复性。最后将得到的各个样本的代谢物质谱分析数据进行所有质谱峰的峰面积积分，并完成质谱峰的校正。

2 结果与分析

2.1 代谢物定性定量分析

利用软件Analyst 1.6.3 处理质谱数据。下图所示为混样质控QC 样本的总离子流图（Total ions current，TIC，即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）及MRM 代谢物检测多峰图（多物质提取的离子流谱图，XIC），横坐标为代谢物检测的保留时间（Retention time，Rt），纵坐标为离子检测的离子流强度（强度单位为cps，count per second）。结果见图2 和图3。

基于数据库MWDB（metware database），对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。图中多反应监测模式MRM 代谢物检测多峰图展示了样本中能够检测到的物质，每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个代谢物。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度（CPS），用Multia Quant 软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积（Area）代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。为了比较所有检测到的代谢物中每个代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间与峰型的信息，对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。图4 展示了随机抽取的代谢物在不同样本中的定量分析积分校正结果，横坐标为代谢物检测的保留时间（min），纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度（cps）。

2.2 代谢物的定性定量分析-QC

质控样本（QC）由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每10 个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。QC 样本质谱检测的正负离子模式的TIC 重叠图如图5 和图6 所示，横坐标表示代谢物检测的保留时间，纵坐标表示离子检测的离子流强度。结果表明质控样本（QC）TIC 重叠图中曲线的重叠性高，无干扰信号，仪器具有较高的稳定性，检测结果可靠。

2.3 主成分分析-PCA

PCA 可了解不同样品间的变异度大小，PCA Plot不同样品间代谢物的分离趋势。主成分分析可解释变异图的横坐标表示各个主成分，纵坐标表示可解释变异，左图为各个主成分相加所占的比例图，累计可解释变异，右图为各个主成分的方差比例，每一点对应着PC1 至PC5，左图的PC1 则对应着右图的PC1，左图的PC2 纵坐标值等于右图的PC1 贡献率加上PC2贡献率，左图的PC3 纵坐标值等于右图中PC1、PC2和PC3 之和，依次类推，当左图中PC5 对应的纵坐标值越接近1，则PCA 的模型越可靠。

样品B1 和B3，对应的代谢物谱明显分离，前两个主要成分（PC1 和PC2）分别为66.4%和9.71%，PC1 值较大，说明B1 和B3 具有较大差异，且图中PC5 接近于1，且主成分贡献率PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，说明PCA 模型解释率很好，如图7 和图8所示。

2.4 OPLS-DA 分析

利用OPLS-DA 模型分析所得的数据，制出样品B1 和B3 的得分图，更加清晰地表示B1 和B3 的代谢物差异。在OPLS-DA 得分图中，横坐标表示预测主成分，可以看出重复样的差异；纵坐标方向表示正交主成分，可看出样品间的差距。如图9 所示，B1 和B3 完全分离开来，说明OPLS-DA 可以很好地区分样品B1 和B3。

OPLS-DA 的S-plot 图能直观地展示每个代谢物的贡献率，它可以比较直观地呈现出样品间的显著差异代谢物。代谢物在模型中各组样品分类甄别中的影响强度用VIP 值表示。图中红色的点代表显著差异代谢物，VIP 值大于等于1；绿色的点代表每个样品都含有的通用代谢物，VIP 值小于1。如图10 所示为样品B1 和B3 的OPLS-Slopt 图。

2.5 差异代谢物的聚类分析

为找出影响茶叶品质比较大的化学成分，可对代谢物在不同样本的积累模式进行聚类分析。横向为样品名称，纵向为代谢物信息，Group 为分组，不同颜色为相对含量标准化处理后得到的数值。如图11 所示，根据各样品差异物的聚类热图分析，B1 和B3 对比有着明确的高表达或低表达的区域。

2.6 差异代谢物的筛选鉴定与分析

鉴于本研究结果具有生物学重复，故选择FC 和VIP 值相结合的方法来选取差异代谢物，并要求同时符合FC≥2 或FC≤0.5 和VIP≥1 两个要求。

火山图上能够很直接地看到样品B1与B3的代谢物差异，图中的点均有与其一一对应的代谢物。绿色点为下降的差异代谢物，红色点为上升的差异代谢物，灰色点为区别较不明显的代谢物。如图12 所示，是样品B1 和B3 的不同代谢物火山示意图。

样品B1 共检测和定量了798 种代谢物，样品B3共检测和定量了802 种代谢物。如图12 所示，与B3相比，B1 的代谢产物中有202 种显著变化的代谢物（SCMs），其中108 种SCMs 的丰度显著降低，而94种显著增加。根据表2，这些SCMs 按照数量的多少通常可以分为黄酮、酚酸类、脂质、氨基酸及其衍生物、其他类、木脂素和香豆素、有机酸、生物碱、核苷酸及其衍生物和鞣质，差异代谢物的上调或下调数量，展示在图13 中。

表2 样品B1 和B3 差异代谢物Table 2 The differential metabolites of sample B1 and B3

2.7 总体的代谢通路分析

差异代谢物在生物体内相互作用，如图14 所示为样品B1 和B3 的KEGG 差异代谢物分类图。对样品B1 和B3 的路径分析表明，差异代谢物在49 条KEGG通路中富集，大多数已经鉴定的差异代谢物存在于苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮的生物合成、黄酮及黄酮醇的生物合成及氨基酸的生物合成等途径中。

3 讨论

刘海燕等[15]概述了黄酮具有很强的抗氧化效果，可将体内的自由基清除，减缓细胞的退化，达到抗衰老的作用。黄酮有着很多的保健功效，可降胆固醇，抗病毒，增强免疫力等。因此，黄酮对茶叶非常的重要。在本研究实验中，品种1（桃形叶）共检测到209种黄酮类物质，品种3（云瑰）共检测到211 种黄酮类物质。其中品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）相比，有37 种黄酮类物质是含量较多的，有54 种黄酮类物质是含量较少的。从黄酮对茶叶的影响来看，品种3（云瑰）制茶的品质较好。

龚雨顺等[16]认为茶叶中酚酸主要有没食子酸、鞣花酸、咖啡酸、间双没食子酸、对香豆酸、茶没食子素、对香豆酰-3-奎尼酸，它们的生物活性对茶叶非常的重要，同时也有着非常高的生物利用度。本实验研究发现，品种1（桃形叶）共检测到130 种酚酸类物质，品种3（云瑰）共检测到131 种酚酸类物质，其中品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）相比，有11 种酚酸类物质是含量较多的，有25 种酚酸类物质是含量较少的。因此，品种3（云瑰）的酚酸类含量较高，品质较好。

赵燕妮等[17]利用脂质组学的方法对黑茶和杜仲叶生殖生长的不同阶段内含脂类成分的变化规律进行研究，指出脂类物质对茯茶香气的形成有着积极的作用，其理论依据对茯茶产业发展和品质改善有着重要的作用。研究发现，品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）都检测到93 种酚酸类物质，其中品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）相比，有20 种酚酸类物质是含量较多的。所以品种1（桃形叶）比品种3（云瑰）在酚酸类物质的含量上更有优势，对茶叶香气等品质的形成更有帮助。

黄秀琼[18]研究表明，春季黄金茶1 号比春季适制绿茶的品种碧香早氨基酸要高，更适合制绿茶，说明氨基酸与茶叶的适制性密切相关。通过代谢组学研究，发现品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）都检测到83种氨基酸及其衍生物，其中品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）相比，有6 种氨基酸及其衍生物是含量较多的，有7 种氨基酸及其衍生物是含量较少的。故品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）二者之间的氨基酸及其衍生物的含量差别不大，从氨基酸及其衍生物的含量方面分析不能很好地比较茶叶的适制性。

王春波等[19]利用代谢组学技术对不同产地都匀毛尖茶的代谢差异进行了分析，鉴定出咖啡碱在小围寨团山产地的样品中含量最高，可作为区分都匀毛尖茶产地的科学依据，同时也指出咖啡碱对茶汤的爽口感起着积极的作用，能与茶汤中的儿茶素等物质发生反应，进而改变茶汤的滋味。本实验研究同样通过代谢组学技术对不同品种的普洱茶进行分析，结果表明品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）的咖啡碱含量差异不明显。故品种1（桃形叶）与品种3（云瑰）对茶汤滋味的影响程度不能很好的区分。

4 结论

中国制茶有着悠久的历史，随着市场的不断发展，制茶工艺也在不断的改进，茶叶品质也在不断地符合人们的不同需求。影响茶叶品质的主要因素有茶叶的内含物、采摘季节、加工工艺和储存方式等，其中茶叶的内含物对茶叶不同品质的形成影响最大。本研究采用代谢组学技术分析了两个不同品种的普洱茶代谢物差异，结果表明，品种1（桃形叶）共检测和定量了798 种代谢物，品种3（云瑰）共检测和定量了802种代谢物，二者之间有202 种显著变化的代谢物（SCMs），品种1（桃形叶）较品种3（云瑰）有108种SCMs 的丰度显著降低，而有94 种显著增加。这些SCMs 按照数量的多少通常可以分为黄酮、酚酸类、脂质、氨基酸及其衍生物、其他类、木脂素和香豆素、有机酸、生物碱、核苷酸及其衍生物和鞣质。且差异代谢物在49 条KEGG 通路中富集，大多数已经鉴定的差异代谢物存在于苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮的生物合成、黄酮及黄酮醇的生物合成及氨基酸的生物合成等途径中。这些代谢物的数量和差异分析可为人们根据不同的需求而选择不同的茶叶品种进行制茶和品质控制提供理论依据和科学指导。