厉桂华 张梦雅 马慧 田悦 焦安欣 郑林启 王畅 陈明 刘向东 李爽 崔清强† 李冠华

1) (山东农业大学信息科学与工程学院,泰安 271018)

2) (山东大学物理学院,济南 250100)

3) (山东大学齐鲁医学院济南市中心医院,呼吸与危重症医学科,济南 250100)

4) (山东建筑大学理学院,济南 250100)

肌酐是肾脏疾病诊断和监测的关键生物标志物,因此,快速、灵敏的肌酐检测非常重要.本文提供了一种通过提高低温下的光子诱导电荷转移效率来促进表面增强拉曼散射光谱(SERS)活性的有效策略.采用种子生长法获得纳米金二十面体(Au20),以此作为SERS 活性基底.采用极低温(98 K)SERS 检测技术实现对染料分子结晶紫(CV)和生理盐水中的肌酐含量的快速、灵敏检测.实验结果表明:常温296 K 下,Au20 基底对CV分子的检测限(LOD)低至10—12 mol/L,并且信号均匀;低温98 K 时,CV 分子的LOD 可达10—14 mol/L,比296 K时降低2 个数量级.最后,使用Au20 基底对生理盐水中的肌酐进行无标记检测.结果表明,常温296 K 时该SERS 基底对肌酐的LOD 为10—6 mol/L,1619 cm—1 峰的线性相关系数为0.9839.低温98 K 时,肌酐的浓度探测极限低至10—8 mol/L,1619 cm—1 峰的线性相关系数变为0.9973.可知,低温使肌酐浓度检测限和特征峰线性度都进一步提高.本文的工作为生物医药领域肌酐浓度的精确检测提供了新的思路.

1 引言

肌酐水平是各种肾脏和肝脏疾病的重要指标.肌酐水平不足表示肌肉萎缩、肝功能低下和体液流失.相反,肌酐水平高表明患有慢性肾脏疾病[1,2].因此,人体的血清、尿液中肌酐的含量检测成为肾、肝功能和肌肉萎缩的重要衡量指标,可以筛查人体是否出现或存在这类疾病.尤其在肾病的临床诊断治疗中,肌酐浓度的精确探测是评估肾功能损伤情况的重要指标.如果分析结果能够与肌酐浓度成比例,那么将为肾脏状态的评估提供重要的参考标准.

在目前的医学实践中,肌酐的定量测定采用化学方法较多[3,4].几种成熟的方法,如比色法、分光光度法和色谱法,已广泛用于肌酐的检测[5-7].然而,这些方法涉及样品处理的很多步骤,需要大量的化学物质和繁琐的样品准备.此外,由于其他化合物的存在,这些方法也容易出现人工错误和干扰,使结果不够准确.近年来,人们越来越关注表面增强拉曼光谱(SERS)技术[8,9],它不仅克服了拉曼光谱信号弱对其应用的制约,还有效消除了样品中荧光的干扰,可以提供丰富的分子“指纹”信息,有助于快速、无损、无标记检测疾病生物标志物,成为未来生化检测领域最有前景的技术之一[10-13].

制约SERS 技术的关键因素在于高性能增强基底的制备.金属材料特别是 Au,Ag,Cu 等纳米构型具备独特的局域表面等离激元共振(LSPR)特性,具有高效可调的光吸收-转化能力,且在可见-近红外光辐照下呈现出优异的光激发响应性能.LSPR 效应产生的局域增强的电磁场,可以显著增强分子的拉曼信号强度,成为目前SERS 效应最强且应用最广泛的基底.目前增强SERS 的办法主要有以下几个方面:1)传统贵金属材料与新型二维材料[14,15]、半导体等材料相结合;2)用先进的实验条件实现对纳米结构的可控制备,构筑特殊纳米结构;3)通过将材料复合同时满足分离、富集、降解及光学成像等多样化应用需求.上述方法对应的SERS基底在制备过程中都变得异常繁琐,而我们另辟蹊径,采用低温方式来进一步提高金属SERS 基底的增强效果[16-18],并取得了不错的结果.由于在低温情况下可以削弱金属晶格振动并减少热声子和光激发电子的复合,从而加速电子迁移,有效提高光子诱导电荷转移效率,最终使SERS 的电磁机制得到加强,即表现为SERS 信号增强,这也验证了文献的结论.

2021 年,Wen 等[19]把自组装纳米Ag/Au@Au复合薄膜SERS 基底用于人血清肌酐的无标记检测,结果表明,该SERS 底物对血清肌酐的LOD为5 × 10—6mol/L,线性相关系数为0.96.Zhu 等[20]首先使用一个简单的溶剂分离步骤,将人类尿液中的肌酐分离出来.然后,采用优化的金溶胶为SERS 基底,使用便携式拉曼光谱仪准确检测人类尿液中的肌酐浓度.并研究和优化了不同凝聚盐对检测肌酐浓度灵敏度的影响,以及盐和金溶胶浓度的影响.最后的LOD 为1.45 mg/L.Kullavadee 和Aroonsri[21]报道,将涂有金膜的纳米结构聚电解质膜用于无标记和选择性肌酐检测.该底物在pH 值处于5—7 的缓冲溶液中表现出良好的肌酐检测性能.通过在人工尿液中进行肌酐分析,发现具有宽线性响应(1 µmol/L—10 mmol/L)的良好灵敏度和1.47 µmol/L 的低检测限.此外,还有工作报道,通过将金纳米颗粒的LSPR 场捕获在蓝光数字多功能光盘的纳米通道中[22],可以有效引导金纳米颗粒的LSPR 场.利用该基底,对稀释后尿液中的三种重要的临床化学物质,即白蛋白、肌酐和尿素的拉曼信号强度进行了可靠的测量和量化.三者对应的最低浓度分别为0.1,0.2 和0.6 µg/mL.Yang课题组[23]报道在金属有机框架材料上生长Au 纳米颗粒,得到了Au@MIL-101(Fe)复合基底.在静电作用下,肌酐分子可以进入孔隙中,达到有效富集.该基底对肌酐的LOD 为0.1 µmol/L.总之,研究人员采用了多种办法来改进SERS 基底,期望获得血肌酐、尿肌酐检测的满意结果.但是,血清肌酐和尿肌酐的含量检测主要侧重前期预防,而在治疗过程中,需要关注生理盐水中的肌酐含量.另外,测量精度仍需要提高.

本实验采用Au20作为SERS 基底,以结晶紫(CV)为探针分子,分别探测了室温(296 K)和低温(98 K)时的检测浓度极限.结果发现:室温时,LOD低至10—12mol/L;低温时,CV 浓度检测限降低至10—14mol/L.这表明,低温可以进一步提高检测精度.接下来,本文仔细对比了296 K 和98 K 下的生理盐水中的肌酐浓度,发现低温下肌酐的特征峰线性度和浓度检测精度都进一步提高,这为准确测量肌酐浓度提供了新的思路.

2 实验部分

2.1 Au20 溶液的制备

本实验通过种子法化学合成获得Au20.首先配置0.01 mol/L 氯金酸(HAuCl4,上海国药,分析纯)50 mL,0.01 mol/L 柠檬酸钠(Na3C6H5O7,麦克林公司,分析纯) 20 mL 及0.1 mol/L 硼氢化钠(NaBH4,上海阿拉丁,分析纯) 20 mL.将0.25 mL HAuCl4和0.25 mL Na3C6H5O7混合,磁力搅拌3 min,加入0.3 mL NaBH4,在室温下静置3 h,得到粉色液体①.然后配置0.05 mol/L 和0.1 mol/L 的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,上海阿拉丁,分析纯)各100 mL,0.1 M 抗坏血酸(AA,麦克林公司,分析纯) 20 mL.取1 mL 溶液①和1 mL AA 搅拌10 min,得到紫色溶液②.取1 mL 溶液②、0.2 mL HAuCl4、7 mL CTAB 和0.1 mL AA 搅拌均匀,静置12 h,得到金二十面体Au20.将产物离心清洗3 次,滴于清洗干净的硅片上自然晾干,用于CV分子和肌酐分子的SERS 探究.

2.2 金纳米颗粒的制备

利用激光液相烧蚀技术制备金纳米颗粒作为对照组.取0.05 mol/L 的CTAB 5 mL,加入去离子水稀释至10 mL,将Au 靶放入溶液中.用1064 nm激光(设定电压900 V,频率10 Hz)烧蚀Au 靶30 min,得到浓红色液体用于后续SERS 性能研究.超声10 min,以转速4000 r/min 的速度离心15 min,移除上层溶液.将留下的沉淀物清洗两次,将产物滴在硅片上晾干备用.

2.3 分子溶液的配置

2.3.1 CV(Sigma,分析纯)溶液的配置

称取4.1553 mg CV 固体粉末溶于10 mL 乙醇中,超声均匀,得到10—3mol/L 的CV 溶液;取1 mL上述CV 溶液溶于9 mL 乙醇中,得到10—4mol/L的CV 溶液.以此类推,通过稀释,分别获得10—5—10—14mol/L 的CV 溶液.

2.3.2 肌酐(MCE,分析纯)溶液的配置

称取1.131 mg 肌酐固体粉末溶于10 mL 生理盐水中,超声均匀,得到10—3mol/L 肌酐溶液;取1 mL 上述肌酐溶液溶于9 mL 生理盐水中,得到10—4mol/L 肌酐溶液.以此类推,通过稀释,分别获得10—3—10—6mol/L 的肌酐溶液.

2.4 仪器介绍

实验过程中,利用紫外-可见-近红外分光光度计(UV-1800,Shimadzu)测量吸收谱,可以表征金属产物的共振吸收峰.纳米结构的表面形貌是在配备X 射线能量色散谱(EDS)的聚焦离子束电子显微镜(FIB,Helios G4UC)下进行观察的.利用高分辨透射电子显微镜(TEM,model JEM-2100F)测量微观形貌及晶格特征.利用X 射线衍射仪(XRD,Smartlab 3 kW)获得晶格结构.SERS 测试采用了50×物镜的共焦微探针拉曼光谱仪(Renishaw 拉曼光谱仪)采集信号,以Renishaw 高功率二极管连续532 nm 激光器作为激发源,到达不同样品表面功率约为0.5 mW,扫描10 次,每次累积时间为1 s,同时采用Linkam 控温池进行温度控制.所有拉曼光谱在后期处理中,均已扣除基线.

3 结果与讨论

首先,采用扫描电子显微镜(SEM)对种子法化学合成的Au20的表面形貌进行了初步表征,如图1(a)所示,发现颗粒大小比较均匀.进一步通过粒径分布去评估颗粒的尺寸及均匀性,如图1(b)所示,发现直径为35—41 nm 的颗粒占比约为60%,这说明Au20的粒径分布确实比较均匀.图1(c)为低倍TEM,清晰地显示Au20的轮廓呈现正六边形.将图1(c)中蓝框区域放大得到了HRTEM 图像(图1(d)),展示了Au20的结构细节,图中标注的晶格条纹0.235 nm 对应于Au 的(111)晶面,并且在面与面之间形成清晰的孪晶缺陷.

图1 (a) Au20 的SEM;(b)粒径分布;(c) Au20 的TEM;(d) Au20 的高分辨率HRTEMFig.1.(a) SEM image of Au icosahedron;(b) statistics of particle size distribution of Au icosahedron;(c) TEM image of Au icosahedron;(d) HRTEM of Au icosahedron.

作为对照,采用激光烧蚀的方法获得了形状均匀的金球颗粒,粒径分布集中在35—45 nm 范围内.图2(a)是较低倍数下金球的整体形貌SEM 图,低放大倍数下的TEM(图2(b))清晰地显示合成的金纳米颗粒具有良好的分散性.接下来对金球和Au20的紫外-可见-近红外吸收光谱进行表征,发现它们的LSPR 共振峰分别位于526 和533 nm.通常,当选用与贵金属纳米颗粒表面LSPR 共振峰相匹配的入射光激发时,就能激发其LSPR 特性,从而导致纳米颗粒附近,特别是颗粒之间的间隙区域产生较高的局域电场,进而能够实现较大的电磁增强区域即“热点”区域的构建[24-27],Chen 课题组[28-30]大量的实验结果也已验证了这一点.基于此,在后续的拉曼测试过程中,选用与两种金纳米结构LSPR峰均匹配的532 nm 的激光作为激发光源.

图2 (a)金球的SEM;(b)金球的TEM;(c)金球和Au20 的紫外-可见-近红外吸收光谱Fig.2.(a) SEM image of Au particles;(b) TEM image of Au particles;(c) UV-vis-IR absorption spectra of Au particles and Au icosahedron.

将金球基底和Au20基底分别浸泡于1 mL 浓度为10—7mol/L 的CV 溶液中,自然晾干,室温下进行SERS 性能测试,对比结果如图3 所示.结果显示,在600—1800 cm—1范围内,以Au 球和Au20作为SERS 基底,都可以实现CV 所有特征峰的精确识别,与以前的报道结果一致[31-33].其中,位于729和761 cm—1处的特征峰归因于环C—H 的弯曲;808,918 和1179 cm—1处的峰与环C—H 的面内变形模式和弯曲振动有关;1378 和1619 cm—1处的特征峰来源于环平面内C—C 和N—苯基的拉伸振动.此时,以1619 cm—1处对应的特征峰的强度进一步评估两种基底对SERS 信号的增强程度.很明显,以Au20为基底,其特征峰对应的SERS 强度可以达到12000 arb.units,约为Au 球基底对应SERS 强度的2 倍.为了进一步验证其增强机制,本文利用COMSOL 软件进行时域有限差分(FDTD)模拟,研究了单个金球和单个Au20表面的相对电场强度(|E|/|E0|,即电场|E|与入射电场|E0|的比值).根据SERS 实验中使用的激光波长,FDTD 模拟的入射波长为532 nm,根据图1(c)和图2(b)的结构详情本文将金球直径设置为37 nm,Au20边长设为18 nm.在相同的色标上记录相对强度进行对比,图4(a)和图4(b)分别给出了两个样品在LSPR激发下的局域电场分布情况.显然,在Au20的棱角处展现出更强的相对电场强度,更利于热点的构建,从而更有利于SERS 活性的提高,结论与图3中的实验结果一致.基于此,再次证明Au20结构的优异性,以此作为SERS 基底,有望实现对特定分子的超痕量检测.

图3 浓度为10—7 mol/L 的CV 分子分别在金球基底和Au20基底上的SERS 图谱Fig.3.Raman spectra of CV molecules with concentration of 10—7 mol/L on gold sphere and Au icosahedron substrates respectively.

图4 时域有限差分(FDTD)模拟的相对电场强度 (a)金球;(b) Au20Fig.4.FDTD calculations of relative electric field intensities for longitudinal and transverse plasmon excitation of individual:(a) Au particles;(b) Au20.

在常温下以Au20为基底,探究了CV 的SERS 最低LOD,测得的光谱如图5(a)所示.CV 分子浓度从10—6mol/L 降至10—12mol/L,光谱的特征峰位置基本保持不变,强度降低.例如,位于1619 cm—1处的特征峰强度从10—6mol/L 对应的21770 arb.units下降到了10—12mol/L 对应的390 arb.units.让人欣慰的是,即使 CV 分子的浓度低至10—12mol/L,其主要特征峰还是能被探测到.因此,常温下Au20对CV 的SERS 最低检测极限约为10—12mol/L.由于图5(a)后半段的峰重叠较多,为了清晰地展示峰强度随浓度的变化,图5(c)列出了1536,1587和1619 cm—1峰的强度值.此外,进一步对Au20基底的均一性进行探究,选用浓度为10—7mol/L 的CV分子对随机采集的20 个点的SERS 光谱进行分析,见图5(b).同时,图5(d)给出了1536,1587 和1619 cm—1峰在这20 个点处对应的强度值,数据显示主要特征峰的强度变化幅度不大,说明基底比较均匀,为后期SERS 性能的探究提供了保障.

图5 (a)不同浓度(10—6—10—12 mol/L)的CV 分子SERS 光谱;(b) 10—7 mol/L 的CV 分子随机采集20 个点的SERS 光谱;(c)对应图(a)中3 个峰的强度值;(d)对应图(b)中3 个最高峰的强度变化曲线Fig.5.(a) SERS spectra of CV molecules with different concentrations (10—6—10—12 mol/L);(b) SERS spectra of 20 points of CV molecule (10—7 mol/L) randomly collected;(c) intensity values of the three peaks in panel (a);(d) variation curve of the intensity values of the three peaks in panel (b).

已有研究报道[16-18,34],采用低温条件可以有效地减弱晶格的热振动,减少声子的释放,在一定程度上抑制声子和电子的相互作用,从而有更多的电子参与局域等离激元共振,进而提高电磁增强效果.为了验证这一点,本文采用较高浓度(10—7mol/L)的CV 分子为探针分子,详细地进行了温度依赖的拉曼光谱检测.首先在常温下采用扫描模式,随机测试了20 个点,结果显示CV 特征峰的强度变化很小,说明基底比较均匀.液氮冻结的周围温度可以从室温(296 K)快速转变为极低温98 K,接下来的实验中,低温控制至98 K.如图6(a)所示,不同颜色的拉曼光谱直观地反映了不同温度下CV 特征波段的粗略演化.图6(b)的拉曼谱线显示了913,1176,1370,1586 和1619 cm—1处CV 分子的特征谱带.从296 K 到98 K,CV 的拉曼振动峰强度随温度的降低呈现增加趋势.特别是在低温98 K 时,1619 cm—1处的信号强度约为28850 arb.units,比常温增强约2.3 倍;913 cm—1处的信号强度约为7600 arb.units,比常温增强约2.6 倍.这种独特的线性关系,非常适用于环境监测中对CV 分子精确浓度的超灵敏探测.

图6 (a) 降温条件下CV (10—7 mol/L)对应的SERS 光谱;(b)不同温度时特征峰的强度变化Fig.6.(a) SERS spectra corresponding to CV (10—7 mol/L) under cooling condition;(b) intensity variation of characteristic peaks at different temperatures.

上述低温SERS 优于常温的实验结果,归因于低温条件削弱晶格热振动可以有效地减少声子辅助弛豫,抑制光子触发电子和晶格振动诱导的热声子的复合[35-37].声子辅助的非辐射复合可以明显减少参与光子诱导电荷转移过程的光诱导电子的数量.因此,可以促进更多电子参与到局域电场的构建,实现物理增强.同时也增加了激发电子的密度进而优化了与附着分子之间的迁移概率,从而促进化学增强.

采用XRD 对温度变化下的Au20的晶相变化进行分析,如图7(a)所示.室温296 K 和低温98 K时Au20纳米晶体结构的XRD 衍射图均呈现面心立方结构.图7(b)给出了Au20在常温和低温下的峰位和最大半峰宽的对比数据.与296 K 时的初始晶体结构相比,低温98 K 时的峰位有轻微偏移(见图7(a)插图),具体偏移角度在0.08°—0.16°范围内.由半峰宽的数据可知,半峰宽最大减小量为0.067,峰形变得更尖锐.这表明低温条件对晶体相变的影响不显著,但是使Au20的结晶度高了,从而使SERS 的电磁机制得到增强.

图7 (a) Au20 不同温度条件下的XRD(插图是衍射峰(311)和(222)的放大图);(b) 与XRD 对应的衍射峰的位置和半高宽Fig.7.(a) XRD of Au20 at different temperatures (inset:the enlarged view of XRD peak at (311) and (222));(b) the table of diffraction peaks position and FWHM in XRD at different temperatures.

上述实验结果表明,低温条件能够显著增强SERS 效果,故本文在最优SERS 活性对应的温度条件(低温98 K)下进一步探究了Au20基底对CV分子的浓度检测极限,结果如图8(a)所示.随着浓度的降低,特征峰的强度显著降低,当浓度达到10—14mol/L 时,仍然能够看到CV 的主要特征峰.因此,本实验利用低温SERS 技术可实现对CV 分子低至10—14mol/L 的检测限.以1173 和1619 cm—1处的峰强度为因变量,以CV 溶液浓度为自变量,图8(b)对它们之间的数量关系进行了研究分析,经过对数线性拟合可以得到以下两个方程:

图8 (a) 低温98 K 时不同浓度(10—8—10—14 mol/L)的CV 分子的SERS 光谱;(b) 1173 和1619 cm—1 特征峰的SERS 强度与CV分子浓度的线性关系Fig.8.(a) SERS spectra of CV molecules with different concentrations (10—8—10—14 mol/L) at low temperature 98 K;(b) SERS intensity of 1173 and 1619 cm—1 peaks proportional to the concentration of CV molecule.

1173 cm—1处:I1173=569.19 lgC+7604.26(线性系数R2=0.8719),

1619 cm—1处:I1619=1848.12 lgC+25146.56(线性系数R2=0.9277).

所建立的线性关系将为精确评估环境监测中CV 残留和基于CV 的环境污染提供良好的理论支撑.

本实验中,基于上述讨论的Au20基底表现出优异的SERS 性能,下面以Au20作为SERS 基底,探究常温和低温下其对肌酐分子的SERS 增强行为,如图9 所示.图9(a)给出了常温SERS 测试结果,肌酐位于 610,916,1178,1310,1361,1509,1587,1619 和1648 cm—1处的特征峰被清晰地标示,为临床诊断提供了丰富的“分子指纹”信息[38].其中,610 cm—1峰归结于N—CH3拉伸和C=O 变形及环振动;806 cm—1归结于C—NH2变形与环振动;916 cm—1处的特征峰来源于C—N 拉伸;1178 cm—1归因于CH2的面外扭曲变形;1300—1600 cm—1主要是由CH2的面外摇摆、CH3的面外摇摆和面外扭曲变形导致的;而在1600—1700 cm—1的区域内,位于1619 cm—1处的SERS 信号峰与NH2和OH2的弯曲振动模式有关.随着肌酐浓度从10—3mol/L降低到10—6mol/L,其特征峰的强度也随之降低.本文选取1178 和1619 cm—1特征峰的SERS强度来分析其与肌酐分子浓度对数的线性变化关系,如图9(b)所示,两条拟合直线的线性系数分别为0.9839 和0.8675.保持肌酐分子的探测浓度范围(10—3—10—6mol/L)不变,进一步探究低温条件下其SERS 活性的变化,相应结果如图9(c)所示.将图9(c)与图9(a)对比,发现每个浓度对应的信号强度明显变大,并且峰形更尖锐,随着浓度的减小,特征峰的变化更具有规律性.即使肌酐浓度低至10—6mol/L,其特征峰依然清晰可辨.同样选取1178 和1619 cm—1两个特征峰,分析强度与浓度对数的线性关系,发现相应两条直线的线性系数分别为0.9973 和0.9861.根据1178 cm—1对应的线性关系可知,肌酐的浓度检测极限可达10—8mol/L.较常温下,不仅浓度的测量极限进一步降低,而且测量精度大大提高.因此,以Au20为SERS 基底,通过低温手段可以进一步促进肌酐分子SERS 活性的提高,并且SERS 光谱展现出良好的线性关系,为肌酐分子浓度的准确探测提供了依据,该结果有希望应用于临床检测中肌酐的定量检测.

图9 不同浓度(10—3—10—6 mol/L)的肌酐分子的SERS 光谱 (a) 296 K;(c) 98 K.1178 和1619 cm—1 特征峰强度与肌酐分子浓度的线性关系 (b) 296 K;(d) 98 KFig.9.SERS spectra of creatinine molecules at different concentrations (10—3—10—6 mol/L):(a) 296 K;(c) 98 K.The variation of the intensity of peaks at 1178 and 1619 cm—1 versus different the molecular concentration of creatinine:(b) 296 K;(d) 98 K.

4 结论

总之,本文提供了一种通过低温手段提高光子诱导电荷转移效率来促进Au20表面增强拉曼散射光谱活性的有效策略.采用的98 K 低温可以有效地抑制光子触发电子和晶格振动引起的热声子的复合.CV 染料分子在常温296 K 时,浓度探测极限为10—12mol/L;低温98 K 时探测浓度低至10—14mol/L.采用相同的方法对生理盐水中的肌酐进行无标记检测.结果表明,在常温296 K 时,该SERS 底物对肌酐的检测限为10—6mol/L,1619 cm—1峰对应的线性相关系数为0.9839.低温98 K 时,肌酐的浓度探测极限低至10—8mol/L,1619 cm—1峰的线性相关系数变为0.9973.可知,低温下Au20基底对肌酐浓度的探测能力和精度较常温下都大幅提高,综上所述,目前的工作为肌酐分子浓度的准确探测提供了更可靠的方案.