李耀英，谢红珍，林乐涛，钟智辉，冯 凯，赵 亮，张艳玲*

(1.南方医科大学基础医学院，3.检验与生物技术学院， 广东 广州 510515；2.中山大学肿瘤防治中心实验研究部华南肿瘤学国家重点实验室，4.微创介入治疗科，广东 广州 510060；5.深圳市第三人民医院放射科，广东 深圳 518112)

我国肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者数量约占全球一半以上，且呈明显上升趋势[1]。植入放射性125I粒子近距离放射治疗(放疗)多种中晚期实体肿瘤效果较佳，相比其他治疗方式作用时间长、不良反应少。125I粒子可持续产生低剂量射线以促进HCC细胞凋亡[2-3]。本研究基于前期构建的125I粒子体外验证模型[3]，观察125I粒子治疗HCC的调控网络。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 PLC/PRF/5细胞及HepG2细胞(ATCC细胞库)，RNA提取试剂盒(上海奕杉生物科技)，Gene Chip prime view human Array人基因表达谱芯片(吉凯基因)，Evo M-MLV反转录试剂(艾科瑞生物科技)，iTaq Universal SYBR©GreenSupermix(美国Bio-Rad)，LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche)，蛋白提取试剂盒(上海奕杉生物科技)，双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1, DUSP1)、Sestrin2蛋白(stress induced protein 2, SESN2)、乙酰基转移酶2(establishment of sister chromatid cohesion N-acetytransferase 2, ESCO2)及人DNA损伤诱导转录因子3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3)抗体(英国abcam)，辣根过氧化物酶偶联的二抗(Santa Cruz)；ChemiDoc成像系统(美国Bio-Rad)。

1.2 细胞培养 将PLC/PRF/5细胞及HepG2细胞以5×104个/孔铺至6孔板；将PLC/PRF/5细胞置于含10%胎牛血清的MEM完全培养基中，将HepG2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，于37℃、5% CO2条件下进行培养，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 分组 选取PLC/PRF/5，分为125I粒子组和空白对照组，均按1×106个/孔将细胞铺于transwell小室上室；基于前期构建的125I粒子体外验证模型[3]，按治疗计划系统(treatment planning system, TPS)规划均匀放置6颗0.8 mCi125I粒子于125I粒子组的下室(图1)，累积接受125I剂量D90为4.5 Gy；对空白对照组下室不做任何处理；5天后收取细胞(图2)，每组3个样本。

1.4 平板克隆实验 选取PLC/PRF/5细胞及HepG2细胞，按1.3分别分为125I粒子处理组和空白对照组进行处理；之后按1×105个/孔将细胞铺于6孔板，每组设置3个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱中，每隔2～3天更换1次培养基；2周后以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)浸洗并用无水甲醇固定，采用5%结晶紫染料染色后，于显微镜下拍照观察。

图1 以 125I粒子处理PLC/PRF/5细胞 A.模型图，transwell小室的上室为PLC/PRF/5细胞，下室为125I粒子； B.transwell小室下室125I粒子分布实物图； C.TPS显示125I粒子位置； D.TPS显示125I粒子辐照范围，蓝圈为下室辐照范围，紫圈为上室辐照范围

图2 TPS计算125I粒子处理5天后PLC/PRF/5细胞剂量曲线及其参数

1.5 免疫荧光染色 将PLC/PRF/5细胞分为125I粒子组和空白对照组进行处理；按1×105个/孔将细胞铺至放有玻片的6孔板，培养72 h后，以PBS浸洗玻片，并采用0.5% TritonX-100将其于室温下通透20 min，再次以PBS浸洗，以山羊血清于室温下封闭30 min，去封闭液并加入γH2AX抗体后于4℃孵育过夜；次日以含吐温-20的PSB(PBS tween-20, PBST)浸洗玻片，之后加入鼠二抗，于37℃下避光孵育1 h，再次以PBST浸洗后滴加DAPI，避光孵育5 min，于荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 提取总RNA 采用RNA提取试剂盒提取细胞样品总RNA。Nanodrop质检正常值为1.90

1.7 基因芯片检测 以agilent 2100分析总RNA样品后，采用GeneChip 3'IVT Express Kit制备aRNA(amplified RNA)，通过二链合成得到双链DNA模板，再经体外反转获得带生物素标记的aRNA；纯化aRNA并将其片段化后与芯片探针杂交，完成后对芯片进行洗染；最后进行扫描，得到原始数据。评价芯片原始数据质量，对质量控制合格的数据进行后续信息分析，包括显著性差异分析及差异基因的功能分析等。

1.8 qPCR下游基因检测 提取PLC/PRF/5细胞样品总RNA后进行反转录；配置iTaq Universal SYBR©GreenSupermix反应体系，于PCR仪中扩增cDNA。以2-ΔΔCt反映基因表达水平。

1.9 蛋白质印迹法检测蛋白 提取PLC/PRF/5细胞总蛋白，以二辛可宁酸含量检测法(bicinchoninic acid assay, BCA)测定蛋白浓度。一抗孵育稀释比例为DUSP1 1∶200，SESN2 1∶300，ESCO2 1∶100，DDIT3 1∶500。DUSP1和ESCO2为兔二抗，SESN2和DDIT3为鼠二抗；均以1∶2 000稀释。

1.10 统计学分析 采用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，以基于经验贝叶斯分布的线性模型[4]计算显著差异水平，并以Benjamini-Hochberg法对显著差异水平进行校正；以|Fold Change|>1.5且FDR(false discovery rate)校正P<0.05为显著差异基因。采用GraphPad prism 8.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，组间行t检验；以Pearson相关性分析评价相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 平板克隆实验及免疫荧光染色 相比空白对照组，125I粒子组PLC/PRF/5及HepG2细胞的平板克隆能力均显著降低(图3A、3B)，PLC/PRF/5细胞内γH2AX荧光明显增加(图3C)。

图3 125I粒子组与空白对照组平板克隆实验及免疫荧光染色图 A、B.PLC/PRF/5(A)及HepG2细胞(B)平板克隆实验； C.PLC/PRF/5细胞免疫荧光染色

2.2 评估芯片数据质量 所有样本的中位数Z-score均小于2，表明芯片实验可靠性高、数据重复性较好，符合继续分析标准(图4A)。125I粒子组及空白对照组PLC/PRF/5细胞样本基因表达的组内r均>0.99而组间r=0.91，符合继续分析标准(图4B)。主成分分析(principal component analysis, PCA)得分图显示，PC1及PC2维度上，125I粒子组及空白对照组组内样本聚集趋势及组间样本分离趋势均明显，符合继续分析标准(图4C)。

图4 芯片数据质量评估 A.相对对数信号强度箱线图(横坐标表示样本名称，纵坐标表示相对对数信号强度)； B.样品基因表达Pearson相关系数分布图(红色表示相关性高，蓝色表示相关性低)； C.PCA得分图(红点代表空白对照组样本，绿点代表125I粒子组样本)

2.3 IPA分析125I粒子调控HCC细胞的经典通路及调控网络 将显著差异基因数据输入IPA软件，行经典通路分析，结果显示，显著差异基因参与的Acute Phase Response Signaling经典通路被抑制时，Z-score为-1.00，Ras、CFB、SAA、RBP及C1等106个基因表达上调，SOCS3、MKK3/6、SOD2、c-FOS及c-JUN等276个基因表达下调。见图5、6。

图5 125I粒子调控HCC细胞的经典通路富集分析统计图 横坐标为通路名称，纵坐标为富集显著性水平(以10为底的负对数变换)；灰色表示无可用的活动模式，白色为Z-score=0，橙色表示通路被激活(Z-score>0)，蓝色表示通路被抑制(Z-score<0)，橙色和蓝色的深浅代表被激活或抑制的程度；Ratio表示显著差异基因数在该信号通路中占所有基因数的比值

图6 显著差异基因参与125I粒子调控HCC细胞的调控效应网络图 (Adhesion of tumor csell lines：肿瘤细胞株黏附；Migration of smooth muscle cells：平滑肌细胞的迁移；Size of animal：动物大小；Cell viability of lymphoma cell line：淋巴瘤细胞系的细胞活力)

2.4125I粒子对HCC细胞中相关mRNA表达的影响 根据上述分析结果，选取Acute Phase Response Signaling经典通路中的24个显著差异基因，于PLC/PRF/5细胞中进行qPCR验证；125I粒子组BMP4、UBD、ESCO2及STS的表达丰度分别为空白对照组的1.81、2.12、1.55及1.65倍，DDIT3、SESN2、DDIT4及DUSP1的表达丰度在空白对照组的占比分别为0.44、0.55、0.55及0.45。见图7A。

图7 125I粒子对PLC/PRF/5细胞中相关基因表达的影响 A.qPCR检测mRNA表达； B.蛋白质印迹法检测Acute Phase Response Signaling经典通路相关蛋白表达

2.5125I粒子对HCC细胞中相关蛋白表达影响 根据上述qPCR检测结果，选取与基因损伤修复相关的4个分子，于PLC/PRF/5细胞中用蛋白质印迹法验证蛋白水平，结果显示125I粒子组ESCO2及DUSP1表达水平低于、而DDIT3高于空白对照组。见图7B。

3 讨论

125I粒子可持续低剂量放射γ射线及X射线，作用于肿瘤细胞G2/M期，抑制有丝分裂并造成DNA双链断裂而引起细胞凋亡，同时可不断产生氧自由基以杀伤肿瘤细胞、减少肿瘤转移[5]。

既往常规放疗研究多集中于探索HCC细胞系放射敏感性机制，如2～6 Gy X射线体外辐射MHCC-97H细胞、胞内解整合素金属蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9, ADAM9)表达上调及核因子E2相关因子2[nuclear factor (erythroid-2 related) factor 2, Nrf2]表达下调，以诱导细胞自噬、降低HCC细胞放射敏感性[6]；4 Gy X射线辐射HepG2和Smmc-7721细胞，miR-621表达上调，抑制组蛋白甲基转移酶 SET domain bifurcated 1(SETDB1)，激活p53信号通路，从而增强HCC细胞放射敏感性[7]；5 Gy X射线辐射HCC细胞，通过重组人GABA受体相关蛋白(GABA receptor-associated protein, GABARAP)促进细胞自噬，使HCC产生放射抗性[8]。125I粒子放疗可上调HCC细胞PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路中的CHOP(即DDIT3)表达[9]，激活生长抑制DNA损伤诱导蛋白34(growth arrest and DNA damage-inducible protein34, GADD34)，促进真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor, eIF2α)去磷酸化，诱导凋亡相关蛋白表达；且CHOP过表达可使Bcl-2表达下调、Bax表达上调，进一步促进HCC细胞凋亡[10]。此外，125I粒子放疗亦可上调HCCLM3细胞内miR-338表达，抑制肝脏磷酸果糖激酶(phosphofructokinase of liver, PFKL)表达，显著降低瓦博格(Warburg)效应，达到治疗目的[11]。

染色体聚集直接决定其稳定性。ESCO2是最重要的染色体聚集调节蛋白之一，在细胞DNA双链断裂损伤修复过程中起重要作用[12]。本研究发现，125I粒子辐照后的HCC细胞ESCO2表达下调，与既往研究[13]结果一致；此时ESCO2表达下调，可致HCC细胞DNA损伤及染色体不稳定而死亡。

DUSP1可致丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)蛋白的磷酸苏氨酸和酪氨酸发生去磷酸化，使MAPK失活；其表达水平在多种癌中均有显著变化。DUSP1过表达可促进非小细胞肺癌细胞生长、侵袭及血管生成[14]。125I粒子辐照后HCC细胞的DUSP1表达下调，提示其可能通过降低HCC细胞侵袭能力、减缓HCC细胞生长而起到治疗作用。

DDIT3(即CHOP)表达产物通过与其他增强子结合蛋白结合而形成异二聚体，并抑制其DNA结合活性，激活内质网应激反应，促进细胞凋亡[15]。125I粒子辐照后HCC细胞的DDIT3表达上调，提示其可能通过促进DDIT3参与的内质网应激反应而促进HCC细胞凋亡。

综上，125I粒子治疗HCC的调控网络包括抑制Acute Phase Response Signaling、下调ESCO2表达、使HCC细胞无法及时修复增殖时发生的DNA损伤，上调DDIT3表达、阻滞HCC细胞生长，下调DUSP1表达、诱导HCC细胞凋亡；上述结论尚有待在体研究结果加以验证。