鲁任翔 王 喆 翟雨佳 金唯新 沈 斐 郑传林*

(1．中国农业大学 园艺学院，北京 100193；2.江苏省无锡市惠山区阳山镇农业服务中心，江苏 无锡 214156)

桃(

Prunus

persica

L.Batsch)是蔷薇科(Rosaceae)李属(

Prunus

L.)植物，原产于我国，迄今为止具有4 000多年的栽培历史，是我国重要的果树之一。我国历史上有四大传统名桃，分别是江苏阳山水蜜桃、浙江奉化水蜜桃、河北深州水蜜桃和山东肥城佛桃，其中阳山水蜜桃因皮薄肉多、细腻多汁、香气浓郁和营养丰富等特点而享誉全国。近年来，随着种植面积增加、种植品种增多以及当地政府的重视，阳山水蜜桃产业得到了高速发展。以2018年为例，阳山水蜜桃的产量达2.12万t，创造了近4亿元的产值，给当地果农带来了巨大的经济效益；同时，阳山水蜜桃的品牌效益也在各级力量的推动下逐渐发展，与10年前相比，阳山水蜜桃的单价几乎翻倍。但是，阳山水蜜桃产业在快速发展的同时也存在着产业隐患，因为阳山镇种植的主栽品种成熟期主要集中在6～8月，桃的成熟和采收阶段与雨季重叠，成熟期的水蜜桃果实腐烂严重，影响了水蜜桃的产量和品质。目前，关于无锡阳山地区桃果实腐烂病原菌分离鉴定的相关研究报道较少，且国内外学者对引起桃果实腐烂的病原菌具有不同观点。通常认为桃果实在成熟和采后阶段容易受到机械伤害，病原菌可通过伤口侵入果实引起青霉病、褐腐病、灰霉病和软腐病等病害，导致果实腐烂。其中，青霉病的病原菌为扩展青霉(

Penicillium

expansum

)，受侵染的果实2～3 d即可发病，且在发病的果实部位可鉴定到1种神经性毒素-展青霉毒素；桃褐腐病在桃果实的整个发育期均可发病，且在成熟前后发病加重，患病果实具有极高的腐烂率，我国的褐腐病主要由链核盘菌(

Monilinia

fructicola

)引起，同时也可由丛梗孢属的2个种

Monilia

mumecola

和

Monilia

yunnanensis

引起；灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌(

Botrytis

cinerea

)，发病果实病斑会由褐色凹陷转变为灰色霉层覆盖全果，导致整个果实快速腐烂；软腐病被认为是由葡枝根霉(

Rhizopus

stolonife

)引起的，该病在0 ℃以下和39 ℃以上不易发病，常温下则发病迅速，3～4 d即可导致果实腐烂。此外，Yaghmour等发现白地霉(

Geotrichum

candidum

，异名

Galactomyces

candidus

)可引起毛桃和油桃等核果类果实的酸腐病并导致果实腐烂，而Ginting等发现桃吉尔霉(

Gilbertella

persicaria

)也引起果实的腐烂。

为进一步明确引起阳山水蜜桃成熟期腐烂的病原菌并筛选针对性强的高效杀菌剂，本研究从江苏省无锡市惠山区阳山镇采集了当地主栽品种‘晚湖景’水蜜桃有腐烂症状的病桃，对其病原菌进行了分离和形态学鉴定，并结合分子生物学方法和菌株回接试验，明确了致病病原菌；利用当地常规使用的杀菌剂农药，如代森锰锌、喹啉铜、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑等，通过抑菌实验评估了这些杀菌剂对致病菌的抑制作用，以期为当地的生产实践提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病样与健康果实：于2020年8月初从无锡市阳山镇采集受病菌侵染的‘晚湖景’水蜜桃，从京东商城购买无机械损伤且无病菌侵染的水蜜桃作为分离菌株的回接试验材料。

试剂及仪器：试剂包括葡萄糖、琼脂、次氯酸钠和75%乙醇等，仪器设备包括：电子天平(PL602E，Mettler Toledo)、超净工作台(单人单面，昌平长城)、恒温震荡培养箱(HZC-280，苏州培英)、超高速冷冻离心机(Centrifuge 5424 R，Eppendorf)、光学显微镜(BX53M，Olympus)、PCR仪(TGRADIENTY96，Biometra)、凝胶成像仪(AlphaImager HP，Alpha)和恒温培养箱(DHP-9012，上海一恒)等。

杀菌剂：代森锰锌(Mancozeb)可湿性粉剂(有效成分80%，西安近代科技实业有限公司)、喹啉铜(Oxine-copper)悬浮剂(有效成分33.5%，山东贵合生物科技有限公司)、甲基硫菌灵(Thiophanate-Methyl)悬浮剂(有效成分50%，山西德威本草生物科技有限公司)和苯醚甲环唑(Difenoconazole)悬浮剂(有效成分30%，陕西先农生物科技有限公司)。

1.2 试验方法

1

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2

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1

病原真菌的分离纯化与形态观察

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)的配制：称取200 g新鲜去皮马铃薯，于800 mL蒸馏水中煮20～30 min后经2层纱布过滤；在滤液中加入20 g葡萄糖和15～20 g琼脂，蒸馏水定容至1 L；121 ℃高压灭菌20 min后倒入无菌培养皿中，凝固后备用。PDB培养液(Potato dextrose broth，马铃薯葡萄糖培养液)的制备：除不加琼脂外，与PDA培养基的配方相同，配制后装入50 mL锥形瓶中，封口灭菌备用。

在阳山镇水蜜桃果园内采集腐烂的病果，立即运回实验室，在无菌的超净工作台内打开。采用组织分离法从病桃上分离病原菌，在操作台中用手术刀在桃的病健交界处切取0.5 cm×0.5 cm的组织块，将切取的组织块经75%乙醇消毒30 s，无菌水漂洗3～4次后用5%的次氯酸钠消毒1 min，无菌水漂洗3～4次。最终将表面消毒的桃组织块在无菌滤纸上吸干水分后，置于PDA培养基平板上，将平板置于30 ℃恒温培养箱中培养。待桃组织周围长出菌落后，用灭菌的枪头在菌落边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA培养基上培养，多次重复分离纯化至单一菌落。挑取上述分离出的单一菌落菌丝，吸取少量蒸馏水制片，在显微镜下观察其菌丝和孢子的形态。

1

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2

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2

病原菌致病性的测定

在分离纯化出的单一菌落上切取菌块到PDB培养液中，于恒温震荡培养箱中培养3 d制备孢子悬浮液。将制备好的真菌悬浮液作为接种体，选取大小均匀、成熟度一致、无机械损伤和无病害的水蜜桃果实进行致病性测定。先用75%乙醇清洗表面30～45 s进行表面消毒，再用无菌水冲洗3～4次，晾干表面水分。用灭菌的10 μL枪头尖端在桃表面造成针孔状伤口，并吸取10 μL悬浮液接种在伤口处，以无菌水作为对照。接种完成后放入培养箱，于室温(25 ℃)、相对湿度约为85%的暗条件进行培养，每隔24 h观察桃伤口的发病情况。从发病的病斑处再次分离纯化病原物，检测是否与接种菌株一致。

1

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2

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3

DNA提取和rDNA

-

ITS检测采用改进的简化CTAB法提取真菌DNA，DNA于-20 ℃冰箱中保存以备后续使用。利用真核生物特异性区段ITS(Internal transcribed spacer)设计引物进行特异性片段的扩增和测序，其中上游引物为ITS5: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，下游引物为ITS4: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反应体系为：总体积25 μL，包含模板DNA 0.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，

Taq

PCR Mix 12.5 μL，ddHO 10 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸15 s，共35个循环，最终延伸7 min后结束扩增反应。经高保真酶扩增后的PCR产物连接到 pClone007 Blunt Vector(擎科，北京)，并转入到大肠杆菌中，摇菌、提取质粒并送往生工生物工程(上海)有限公司完成测序。利用NCBI网站的BLAST(Basic local alignment search tool)工具对测序结果进行序列比对，在线搜索相似性较高的序列，使用MEGA X软件以邻接法对菌株ITS序列及比对获得的序列构建系统发育树，分析其亲缘关系，根据相似性的高低，确定分离菌株所在的属和对应的种。

1

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2

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4

抑菌试验

本试验选取在阳山镇水蜜桃种植基地常见的杀菌剂代森锰锌、喹啉铜、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑作为试验农药。分别将相关剂量的杀菌剂加入到55 ℃ 未凝固的PDA培养基中，摇匀后倒平板，获得不同浓度梯度杀菌剂的培养基(1 000、3 000和5 000倍稀释)。用灭菌的枪头圆端(直径6.5 mm)在生长单一纯化菌落的平板上打下菌落，并接种在含药培养基的中央。接菌后放置在30 ℃恒温培养箱中培养，每隔24 h用“十字交叉法”测量菌斑的直径。利用以下公式计算杀菌剂对致病菌的生长抑制率：

生长抑制率

1.3 数据分析

试验数据使用Microsoft Excel 2019和SPSS 26.0软件进行统计分析，差异显著性检验使用LSD法，本试验中的差异显著性水平均为

P

<0.05。

2 结果与分析

2.1 病原真菌的分离鉴定与形态学观察

从40个‘晚湖景’水蜜桃病果上依据形态学特征共分离出51株真菌，依据形态特征分为2类，分别编号为J1和J2，其中J1分离出48株，J2分离出3株。在400倍光学显微镜对菌株的形态和产孢结构进行观察(图1)。

(a)和(b)分别为J1的菌落形态和孢子形态，(c)和(d)分别为J2的菌落形态和孢子形态。(a) and (b): The morphology of J1 colony and spore, respectively; (c) and (d): The morphology of J2 colony and spore, respectively.图1 病原菌的形态观察与镜检结果Fig.1 Morphological observation and microscopic examination of pathogenic fungi

J1菌株在PDA培养基上菌落呈圆形、扁平、乳白色酵母状至白色霉菌状；菌丝短绒状或近于粉状，呈放射型生长(图1(a))。菌丝有横隔、无色、具分枝，宽3.60～12.97 μm，平均宽6.62 μm。菌丝生长到一定阶段后从横隔膜处断裂形成许多节孢子，孢子短而两端平切，呈短柱状、圆筒状或两端钝圆；孢子大小为(3.39～9.27) μm×(2.05～7.71) μm，平均6.78 μm×4.83 μm(图1(b))。根据形态特征初步鉴定为白地霉。

J2菌株初期菌落平铺，绒毛状，中部略隆起，初为乳白色，后渐变呈暗灰色(图1(c))。孢囊梗直立或弯曲，无隔膜，孢囊梗宽10.37～29.18 μm，平均宽15.98 μm；梗端膨大成椭球形的孢子囊，孢子囊的大小为(63.05～100.18) μm×(44.52～84.66) μm，平均80.77 μm×61.51 μm。孢囊孢子近椭圆或圆形，多数呈粒状，一端尖，一端钝圆，大小为(4.81～8.79) μm×(2.57～5.93) μm，平均6.37 μm×4.21 μm(图1(d))。根据形态特征初步鉴定为桃吉尔霉。

2.2 分子生物学鉴定

以48个J1菌株和3个J2菌株基因组的DNA为模板，分别利用ITS引物ITS5/ITS4进行PCR扩增，2类真菌分别得到了大小一致的条带，其中J1菌株约为400 bp，J2菌株约为700 bp。由于分离到的48个J1菌株和3个J2菌株在各自群体中的菌株形态学特征及培养性状基本一致，因此分别随机选择3株J1菌株和J2菌株的PCR产物进行测序。将2种真菌的ITS产物测序序列分别在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果显示J1菌株序列(登录号MW493646)与NCBI上序列登录号为GQ376093.1的白地霉序列一致性达100%，与登录号为KM461121.1的白地霉序列一致性达99.49%(图2(a))。J2菌株序列(登录号MW493705)的比对结果显示其与分离自草莓果实的桃吉尔霉序列(登录号MK301176.1)一致性达100%，与登录号为MH855278.1的桃吉尔霉序列一致性达99.69%(图2(b))。分别取10个不同菌株序列与J1和J2 ITS序列一起构建系统发育树，结果显示J1菌株为白地霉，J2为桃吉尔霉(图2)。以上结果表明，2种真菌的ITS比对结果与形态学观察鉴定的结果一致。

图2 J1(a)和J2(b)菌株的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of J1 (a) and J2 (b) strains with the sequence alignment results

2.3 致病性测定

按照1.2.2的方法进行病原菌致病性的检测，分别回接J1和J2菌液至大小均匀、成熟度一致、无机械损伤且无病害的水蜜桃果实。结果显示2种真菌对桃果实的侵染情况不一致：白地霉回接1 d后，接种部位出现小范围凹陷褐化，2 d后开始生出乳白色、短绒状且呈发射型生长的菌丝，3 d后，接种桃表面出现大面积凹陷、溃烂，患病处白色粉末状菌丝致密；桃吉尔霉回接1 d后，接种部位小范围凹陷褐化，2 d后，接种部位周围出现大面积软腐，有凸起的白色至灰色致密霉层伴随少量黑褐色孢子囊，3 d后整个桃表面都被霉层覆盖，表明桃吉尔霉在桃的采后阶段具有很强的传播能力；对照伤口处无发病现象(图3)。以上症状与田间观测到的成熟病果的发病症状一致。从果实接种后发病部位进行病菌的再分离纯化，得到与接种菌株一致的病原菌，致病性测定符合柯赫氏法则。因此，可初步认定，桃吉尔霉和白地霉是造成桃果实软腐的致病菌，其中桃吉尔霉具有更强的致病力。

24、48和72 h表示接种时间。24, 48 and 72 indicates the inoculation time.图3 白地霉和桃吉尔霉接种桃果实的发病情况Fig.3 Disease symptoms of peach re-inoculated with the isolated G. candidum and G. persicaria

2.4 杀菌剂对病原菌的抑菌效果

本试验结合无锡阳山当地桃农对病害的防治习惯，利用当地常规使用的杀菌剂农药，测试了不同浓度梯度的杀菌剂对致病菌的抑制效果(图4)。研究结果显示，对于白地霉菌，含有效成分33.5%喹啉铜悬浮剂或80%代森锰锌可湿性粉剂均对白地霉菌丝的生长具有良好的抑制效果且该效果随着药剂浓度的降低而减弱，其中，二者1 000倍液都完全抑制了白地霉菌丝的生长；而含有效成分50%甲基硫菌灵悬浮剂和30%苯醚甲环唑悬浮剂对白地霉菌丝的生长抑制效果均低于65.0%，且不同药剂浓度间的抑制效果差别不显著。对于桃吉尔霉，33.5%喹啉铜悬浮剂1 000倍液对桃吉尔霉的抑制效果最好，药剂抑制率可达86.4%；30%苯醚甲环唑悬浮剂对桃吉尔霉的抑制效果低于65.0%，且不同浓度间的抑制效果差别不显著；80%代森锰锌可湿性粉剂和50%甲基硫菌灵悬浮剂的抑制效果极弱，相较于对照无显著差异。综合比较4种杀菌剂对这2种致病菌的抑制效果，含有效成分33.5%喹啉铜悬浮剂的抑制效果好，其1 000倍液对2种致病菌都有强力的抑制效果(图5)。

1 000、3 000和5 000分别表示杀菌剂的相应稀释倍液。图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。1 000, 3 000 and 5 000 respectively represent the corresponding diluted solution of fungicides. Different letters indicate significant difference(P<0.05).图4 4种杀菌剂对分离鉴定到的2种致病菌的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of four fungicides on the two identified pathogenic fungi

图5 喹啉铜1 000倍液对白地霉和桃吉尔霉的抑制效果Fig.5 The inhibitory effect of 1 000 dilutions of oxine-copper on G.candidum and G. persicaria

3 讨论与结论

阳山镇地处江苏省无锡市，每年夏季都会面临大规模的降雨，与阳山水蜜桃的成熟采收期重叠，高湿和雨水环境会导致病原菌大量滋生蔓延，严重影响了水蜜桃的产量和品质。桃吉尔霉造成的果腐病往年在阳山镇个别果园中也偶有发生，及时防治阻止进一步蔓延没有造成大范围危害。相较于往年，2019年夏季阳山地区降雨尤为频繁，6—9月的降雨量达到了142.03 mm，其余各月的平均降水量仅有57.80 mm。有研究表明，桃吉尔霉在15～37 ℃范围内均能生长，最适温度为32 ℃，最适宜pH为5.0～6.0。高温高湿的桃园环境可能是导致桃吉尔霉大范围暴发的直接原因。

本研究从阳山水蜜桃的病桃中分离鉴定出白地霉和桃吉尔霉，依据柯赫氏法则，分别接种分离的白地霉和桃吉尔霉于健康水蜜桃果实，对应果实发病后又分别分离纯化出相应的病原菌，由此确定这2种病原菌是无锡阳山地区成熟水蜜桃果实腐烂的病原菌。此前，国际上已有相关报道，白地霉会导致草莓、枇杷、马铃薯和桃等果实发生酸腐病害，而桃吉尔霉会造成桃、茄子、草莓、木瓜和黑莓等果实的软腐病害。在我国，也有相关报道显示，白地霉可侵染桑葚果实和马铃薯等引起酸腐病害，降低了果实品质，造成了巨大的经济损失；桃吉尔霉能够引起火龙果的软腐病害，在一些火龙果园造成了较大范围的侵染。本研究首次从受病害侵染的‘晚湖景’水蜜桃中分离鉴定出白地霉和桃吉尔霉，为当地今后的桃果实真菌病害防控提供了重要的理论支撑。

本研究通过选用当地常规使用的4种杀菌剂并测试其抑菌效果后发现，喹啉铜作为一种喹啉类保护性广谱、高效、低毒和低残留的杀菌剂，其1 000倍稀释液对白地霉和桃吉尔霉这2种致病菌都有较好的抑制效果，且该浓度在田间试验效果评价中未见药害发生。因而，喹啉铜可作为候选药剂用于当地今后桃生产中防控真菌病害引起的腐烂病害。但是相关研究结果显示，喹啉铜的半衰期在苹果中为4.4～7.4 d，在黄瓜中为2.6～4.1 d，在枇杷中为3.4～4.6 d，使用不当可能会污染环境，甚至危害人类健康，因此应在今后的生产中规范喹啉铜的使用。