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UHPLC-MS/MS 法测定坤宝丸中麦冬及其掺伪品的4 种特征成分

2022-07-22周恒曹依敏陈铭兰岚孙健毛秀红季申

中成药 2022年6期
关键词:麦冬皂苷甲基

周恒曹依敏陈铭兰岚孙健毛秀红季申

(上海市食品药品检验研究院,国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室,上海201203)

坤宝丸是由酒女贞子、覆盆子、麦冬等23 味药材组成的中药复方制剂,具有滋补肝肾、镇静安神等功效,临床上对妇女绝经前后及更年期综合征有较好的疗效[1-4]。麦冬是坤宝丸主要药味,但山麦冬性状与其相似,导致长期以来在中药材市场上存在山麦冬代替麦冬的现象。文献[5-11]报道,甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 等高异黄酮是麦冬特征成分,而山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C 分别是山麦冬2 个基原药材湖北麦冬、短葶山麦冬特征成分,上述化合物均可作为检测指标用于区分麦冬和山麦冬,近几年来也逐步应用于含麦冬制剂中山麦冬掺伪的筛查[12-13]。

由于麦冬处方量在坤宝丸中不足2%,故需要建立灵敏准确的方法对该药材及其掺伪品山麦冬进行分析,但传统的TLC 法、HPLC-ELDS 法由于灵敏度不足,专属性不强,均无法满足检测要求[14-15]。因此,本实验采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UHPLC-MS/MS)法测定坤宝丸中麦冬及其掺伪品中甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B,山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C 这4 种特征成分的含量,以期实现对该制剂中正品麦冬的质量控制,也可对制剂中是否存在山麦冬掺伪麦冬投料进行准确判断。

1 材料

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);Triple Quad 6500 型三重四极杆串联质谱仪,配置MultiQuant 数据处理软件、电喷雾源(美国AB SCIEX 公司);BP211D、CP224S 型电子分析天平(德国Sartorius 公司);Centrifuge 5810R 型离心机(德国Eppendorf 公司);Mikro 200R 型高速冷冻离心机(德国Hettich 公司);Elmasonic E300H 型超声波清洗仪(德国Elma 公司);Milli-Q 型超纯水系统(美国Milipore 公司);Multivap 113型氮气吹干仪(美国Organomation 公司)。甲基麦冬黄烷酮A(批 号Z11N8X48156)、甲基麦冬黄烷酮B(批 号Y25A10L86868)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司;山麦冬皂苷B(批号111907-201001)、短葶山麦冬皂苷C(批号111908-201001)对照品均购自中国食品药品检定研究院。坤宝丸共179批,均为市售品,具体信息见表1。色谱纯甲醇、乙腈(德国Merck 公司);色谱纯甲酸(美国Fisher Scientific 公司)。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);流动相0.1% 甲酸(A)-乙腈(B),梯度 洗脱,程序见表2;体积流量0.4 mL/min;柱温35 ℃;进样量5 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 电喷雾(ESI)离子源,正负离子扫描;多反应监测(MRM)模式;电喷雾电压5 500 V(正离子)、-4 500 V(负离子);离子源温度500 ℃;气帘气(CUR)20.0 psi(1 psi =6.895 kPa);碰撞气(CAD)7.0 psi;雾化气(氮气)50.0 psi;辅助气50.0 psi;射入电压(EP)10 V;射出电压(CXP)15 V。其他参数见表3。

表3 各成分质谱参数

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取各对照品,70%甲醇制成每1 mL 含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 各1 mg 的贮备液,精密量取适量,70%甲醇定容至100 mL,制成1 000 ng/mL 溶液,依次稀释至5、10、50、100、200、400 ng/mL,即得,在4 ℃下保存。

2.3.2 供试品溶液 精密称取本品粉末0.5 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入70% 甲醇25 mL,称定质量,超声(250 W、40 kHz)处理120 min,放冷,70%甲醇补足减失的质量,摇匀,4 000 r/min 离心5 min,取上清液1 mL,14 000 r/min 离心5 min,取上清液,即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按处方配比,制得缺麦冬的阴性样品,按“2.3.2”项下方法制备,即得。

2.4 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定,结果见图1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分MRM 离子流图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项下不同质量浓度对照品溶液各5 μL,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,结果见表4,可知各成分在5~400 ng/mL范围内线性关系良好。

表4 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 精密吸取50 ng/mL 对照品溶液5 μL,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次,测得山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 峰面积RSD 分别为2.8%、2.6%、2.2%、1.9%,表明仪器精密度较好。

2.5.3 重复性试验 取本品(85 号)粉末0.5 g,按“2.3.2”项下方法制备6 份供试品溶液,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定,测得山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷含量RSD 分别为4.2%、3.6%;取本品(10 号)粉末0.5 g,按“2.3.2”项下方法制备6 份供试品溶液,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定,测得甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 含量RSD 分别为5.1%、3.8%,表明该方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密称取阴性样品0.5 g,共9份,置于具塞锥形瓶中,加入低、中、高水平(2.5、5、10 μg/g)对照品溶液,每个水平3份,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定,计算回收率。结果,山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 平均加样回收率分别为108.6%、105.0%、91.2%、91.3%,RSD 分别为4.5%、4.0%、4.6%、4.5%。

2.5.5 基质效应试验 取阴性样品0.5 g,共6份,按

“2.3.2”项下方法处理,氮吹仪上40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL,分别加入100 ng/mL 对照品溶液50、100 μL,1 000 ng/mL 对照品溶液50、100、200、400 μL,70%甲醇定容至1 mL,涡旋混匀,14 000 r/min 离心5 min,取上清液,即得基质对照品溶液(5、10、50、100、200、400 ng/mL),分别精密吸取5 μL,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定,按“2.4.1”项下方法进行回归,计算斜率,测定基质效应,公式为基质效应= [(基质匹配回归方程斜率/溶剂回归方程斜率)-1]×100%。结果,山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 基质效应分别为-2%、4%、12%、11%,均不明显[16-17],表明可采用溶剂回归方程代替基质匹配回归方程来进行定量分析。

2.5.6 检出限考察 检出限以基质对照品溶液的最低浓度值(LCL)为标准进行计算,测得山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 检出限均为0.25 μg/g。

2.6 样品含量测定 取179 批样品,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,每批2份,在“2.1”“2.2”项条件下进样测定,计算含量,结果见表5。由此可知,53 批检出山麦冬皂苷B,58 批检出短葶山麦冬皂苷C,8 批同时检出山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C,其余60 批仅检出甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B。另外,在检出山麦冬皂苷B 或短葶山麦冬皂苷C 的119 批样品中,有8 批也同时检出甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B。

表5 各成分含量测定结果(μg/g)

3 讨论

3.1 麦冬特征成分选择 谈梦霞等[9]通过PLS-DA 发现,与山麦冬比较,麦冬中赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、麦冬皂苷D、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 含量较高,可作为两者差异成分;本实验发现,与甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 比较,相同质量浓度的麦冬皂苷D 对照品溶液在质谱中的响应要低100~300倍,而且在麦冬、山麦冬中的含量差异也更小,故以麦冬皂苷D 为麦冬特征成分可能会造成误判。另外,坤宝丸药味复杂,赖氨酸、精氨酸、缬氨酸等氨基酸的专属性较差,也无法用于麦冬、山麦冬的区分鉴定,故最终选择甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 作为麦冬特征成分。

3.2 结果分析 179 批坤宝丸中有119 批检出山麦冬特征成分,占总量的66.5%,表明麦冬与山麦冬混用现象较为普遍,但2015 年版《中国药典》 暂未对坤宝丸中麦冬成分设置质控项目,相关标准有待修订完善。文献[6]报道,湖北麦冬中山麦冬皂苷B 含量为80~150 μg/g,而其须根中该成分含量达1 090~2 830 μg/g。假设坤宝丸完全使用湖北麦冬投料,以处方量占比2%计算,则山麦冬皂苷B 含量应大致为1.6~3.0 μg/g,但本实验发现部分样品中该成分实际含量明显超出了这一范围,推测可能存在湖北麦冬须根投料的情况,需引起关注。

4 结论

本实验建立UHPLC-MS/MS 法测定坤宝丸中麦冬及其掺伪品的4 种特征成分含量,该方法样品前处理快速简便,检测灵敏度较高,准确度良好,可为该制剂质量控制提供可靠的分析手段和参考依据。

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