何丹娟，梁少荣，陈碧娟

(1.华中科技大学同济医学院附属湖北妇幼保健院中西医结合科，湖北 武汉 430000；2.华中科技大学同济医学院附属湖北妇幼保健院生殖中心，湖北 武汉 430000)

反复自然流产是常见的人类生殖疾病，发病率呈上升趋势，给女性身心健康造成严重影响[1]。反复自然流产发病机制复杂，母胎免疫耐受与母胎界面免疫微环境稳态关系密切，母胎免疫耐受机制在发病过程中起关键作用[2-3]，此外，辅助性T细胞Th1/Th2平衡在免疫微环境的调控中发挥重要作用，可能参与母胎免疫耐受[4]。因此，探讨反复自然流产母胎界面免疫微环境的调节机制，并寻找有确切疗效的药物具有重要临床意义。中医药在反复自然流产的临床治疗中有重要地位。反复自然流产属“滑胎”范畴，中医认为肾气不固、肾精亏虚、气血两虚、阴血损耗是其主要病机[5-6]。固肾养阴汤是根据反复自然流产病机、临床辨证论治原则，总结寿胎丸与安奠二天汤化裁而成，该方由菟丝子、续断、桑寄生等中药组成，具有固肾养阴安胎之功效。本研究旨在探讨固肾养阴汤对反复自然流产模型小鼠母胎界面Th1/Th2平衡的调节作用，以期为其临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠24只，雄性BALB/c小鼠6只，均为7周龄，体质量18～22 g，购自华中科技大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2019-0009。

1.2 药物 固肾养阴汤组方为菟丝子(批号2011002S)15 g，续断(批号2009001S)、补骨脂(批号2005001S)、山茱萸(批号2009001C)、阿胶(批号1903005C)各10 g，桑寄生(批号1910001S)、黄芪(批号2006008C)各20 g，杜仲(批号1912002C)、生地黄(批号2007012C)各12 g，枸杞子(批号2006004S)、黄芩(批号2008004C)各9 g，上述药物均购自合肥华润三九医药有限公司，经湖北省妇幼保健院梅凌峰主管药师鉴定为正品。所有中药混合，水煎2次，合并药液煎煮制成生药量为1 g/mL的浓煎液，4 ℃保存备用。黄体酮胶囊(益玛欣，国药准字H20041902，规格50 mg，批号20200106)购自浙江仙琚制药股份有限公司。

1.3 试剂 小鼠IFN-γ、IL-10 ELISA试剂盒(滁州仕诺达生物科技有限公司，货号SND-M010、SND-M195)；实时荧光定量聚合酶联反应试剂盒、逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司，货号RR820A、RR037Q)；BCA蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号23225)；兔抗小鼠细胞因子信号传递抑制因子SOCS1、SOCS3一抗(英国Abcam公司，货号ab280886、ab280884)；辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG二抗(北京百奥莱博科技有限公司，货号WK355-FOV)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计和合成。

2 方法

2.1 分组与建模 参考文献[7]方法，60只雌性CBA/J小鼠按照体质量排序法随机分为正常组、模型组、黄体酮组、固肾养阴汤组、中西药合用组，每组12只。正常组雌鼠与BALB/c雄鼠2∶1合笼，其余各组雌鼠与DBA/2雄鼠2∶1合笼，次日清晨检出阴栓或阴道分泌物涂片见精子则建模成功，为孕0 d。正常组12只、模型组10只、黄体酮组10只、固肾养阴汤组11只、中西药合用组11只建模成功入组。

2.2 给药方法 根据临床等效剂量换算[8]黄体酮给药剂量为0.4 mg/kg，固肾养阴汤给药剂量为28 g/kg。黄体酮组小鼠灌胃给予0.4 mg/kg黄体酮(蒸馏水稀释)，固肾养阴汤组小鼠灌胃给予28 g/kg固肾养阴汤，中西药合用组小鼠同时灌胃给予0.4 mg/kg黄体酮和28 g/kg固肾养阴汤，正常组、模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1次，孕0～15 d连续给药。

2.3 流产情况及组织取材 孕15 d处死各组小鼠，剖腹取完整子宫组织，记录吸收胚胎数和正常胚胎数，正常胚胎大小均一，肉眼可见红色条索状胎盘；吸收胚胎大小不均一，子宫呈黑色或紫褐色。计算胚胎吸收率，公式为胚胎吸收率=吸收胚胎数/总胚胎数×100%。取胎盘组织(含蜕膜组织)，部分置于40%中性甲醛中固定48 h备用；部分置于-80 ℃保存备用。

2.4 母胎界面组织病理形态观察 取固定于40%中性甲醛中的胎盘组织，常规石蜡包埋，制作4 μm的连续切片，然后行常规苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，于光学显微镜下观察母胎界面组织病理形态改变情况。

2.5 ELISA法检测白细胞介素10(IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)水平 取-80 ℃保存子宫组织，称定质量后剪碎，按照子宫组织与磷酸盐缓冲液质量比1∶9加入磷酸盐缓冲液，于冰上匀浆，预冷离心机12 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，取匀浆上清液，采用ELISA法并根据试剂盒说明书操作，检测IL-10、IFN-γ水平，于490 nm处检测光密度值，计算待测样本浓度。

2.6 母胎界面组织中SOCS1、SOCS3 mRNA表达检测 取-80 ℃保存子宫组织，称定质量后采用Trizol法[9]提取总RNA，酶标仪检测总RNA纯度，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定；反转录获得互补链cDNA，以之为模板链进行实时荧光定量PCR反应，按照SYBR Premix Ex Taq II试剂盒说明书设定反应体系，反应条件为95 ℃预变性90 s；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45个循环，72 ℃再延伸5 min；以GAPDH为内参对照，按照2-△△CT法[10]计算SOCS1、SOCS3表达。引物序列为SOCS1正向5′-ACACGTAGGTGCTAGTG-3′，反向5′-CCTAGCTGCTATG CTGA-3′；SOCS3正向5′-GCTGCTGATATGCTGAT-3′，反向5′-ATGCTGATGTCGTGATC-3′；GAPDH正向5′-GGATGCTG ATGTCGTAGCA-3′，反向5′-TAGCTGTAGCTGTAGTCGT-3′。

2.7 母胎界面组织中SOCS1、SOCS3蛋白表达检测 取-80 ℃保存子宫组织，称定质量后置于液氮中研磨，加入RIPA裂解液冰上孵育25 min，12 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，取上清液测定蛋白总量。取50 μg待测蛋白与等量上样缓冲液混匀，沸水水浴10 min变性，于80 V/120 V进行SDS-PAGE电泳分离，经湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜上，加入脱脂奶粉封闭2 h，充分洗膜，加入1∶200 SOCS1，1∶400 SOCS3一抗，4 ℃摇床过夜；充分洗膜，加入1∶1 000稀释二抗，37 ℃孵育1 h；充分洗膜，加入电化学发光液显影，扫描拍照后，图像分析软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值代表蛋白表达。

3 结果

3.1 胚胎吸收率 正常组、模型组、黄体酮组、固肾养阴汤组、中西药合用组胚胎吸收率分别为(5.50±1.24)%、(28.54±3.29)%、(21.26±3.57)%、(17.41±3.20)%、(12.85±2.72)%，与正常组比较，模型组小鼠胚胎吸收率升高(P<0.05)；与模型组比较，黄体酮组、固肾养阴汤组和中西药合用组小鼠胚胎吸收率均降低，并且中西药合用组<固肾养阴汤组<黄体酮组(P<0.05)。

3.2 各组小鼠母胎界面组织病理形态改变 正常组蜕膜细胞形态正常，排列整齐，血管丰富，绒毛形态正常；模型组小鼠蜕膜细胞变性，部分坏死，蜕膜细胞连接丧失，血管较少，绒毛形态不一，排列紊乱，多量炎性细胞浸润；黄体酮组小鼠蜕膜组织中血管稍增多；固肾养阴汤组和中西药合用组小鼠蜕膜组织、绒毛形态明显改善，血管更为丰富，中西药合用组改善最为明显，见图1。

图1 各组小鼠母胎界面组织病理形态(HE，×100)

3.3 各组小鼠母胎界面匀浆上清液中IL-10、IFN-γ水平 与正常组比较，模型组小鼠母胎界面匀浆上清液中IFN-γ水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；与模型组比较，黄体酮组、固肾养阴汤组和中西药合用组小鼠母胎界面匀浆上清液IFN-γ水平均降低，IL-10、IL-10/IFN-γ水平升高，且各指标活性强度表现为中西药合用组>固肾养阴汤组>黄体酮组(P<0.05)，见表1。

3.4 各组小鼠母胎界面组织中SOCS1、SOCS3 mRNA表达 与正常组比较，模型组小鼠母胎界面组织中SOCS1 mRNA表达升高，SOCS3 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，黄体酮组、固肾养阴汤组和中西药合用组小鼠母胎界面组织中SOCS1 mRNA表达均降低，SOCS3 mRNA表达均升高，且各指标活性强度表现为中西药合用组>固肾养阴汤组>黄体酮组(P<0.05)，见表2。

表1 各组小鼠母胎界面匀浆上清液中IL-10、IFN-γ水平

表2 各组小鼠母胎界面组织中SOCS1、SOCS3 mRNA表达

3.5 各组小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表达 与正常组比较，模型组小鼠母胎界面组织中SOCS1蛋白表达升高，SOCS3蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，黄体酮组、固肾养阴汤组和中西药合用组小鼠母胎界面组织中SOCS1蛋白表达均降低，SOCS3蛋白表达均升高，且各指标活性强度表现为中西药合用组>固肾养阴汤组>黄体酮组(P<0.05)，见表3、图2。

表3 各组小鼠母胎界面组织中SOCS1、SOCS3蛋白表达

图2 小鼠母胎界面组织中SOCS1、SOCS3蛋白Western blot条带图

4 讨论

反复自然流产由遗传因素、环境因素等多种因素交互作用而致，但仍有50%左右原因不明[11-12]。临床常用激素类药物治疗，但效果尚不理想[13]。母胎界面免疫微环境失调与反复自然流产关系密切，改善母胎界面免疫微环境诱导母胎免疫耐受，对提高妊娠成功率有重要意义[14]。

中医药历史悠久，古今中医药典籍中有许多诊治滑胎的方略，安胎疗效确切[15-16]。固肾养阴汤由《医学衷中参西录》中的寿胎丸和《傅青主女科》中的安奠二天汤结合而来，方中含菟丝子、续断等11味中药，多味药相互配合，达到固肾养阴、健母益胎的功效。

本研究中黄体酮、固肾养阴汤单独及联合给药后，反复自然流产小鼠胚胎吸收率降低，母胎界面蜕膜组织病理改变有所改善，IFN-γ水平降低，IL-10水平、IL-10/IFN-γ比值升高，组织中SOCS1 mRNA和蛋白表达降低，SOCS3 mRNA和蛋白表达升高，且各指标活性强度表现为中西药合用组>固肾养阴汤组>黄体酮组，说明黄体酮和固肾养阴汤均能改善母胎界面免疫微环境，抑制SOCS1，促进SOCS3转录和表达，且联合用药效果最好。研究发现，胎儿对于母体属于非己抗原，母体识别抗原则产生免疫应答，母体通过调控免疫平衡产生免疫耐受则胎儿顺利植入胎盘，否则易排斥胎儿造成流产[17]。Th1/Th2免疫平衡在母胎界面胚胎植入过程中发挥重要调控作用。Th1细胞及其细胞因子可从多方面影响胚胎植入，如IFN-γ可下调主要组织相容性复合体(MHC)表达而使胎盘受到机体免疫攻击；IFN-γ的细胞毒作用可破坏胎盘结构，同时可促进黄体细胞凋亡导致孕酮水平降低[18-19]。Th2细胞及其细胞因子IL-10、IL-4可抑制机体免疫炎症反应，具有Th1负性调节作用[20]。药理学研究表明，滋阴药对过亢免疫反应具有抑制作用，可调节机体免疫力[21]。菟丝子等药物中含有类雌激素，利于促黄体生成素释放激素的释放及卵巢对其反应性[22]。Mesaki等[23]发现，SOCS家族分子具有负反馈调节作用，与机体免疫，尤其是与Th1/Th2免疫平衡关系密切。SOCS1具有抑制Th1细胞及其细胞因子的作用，但过度表达可抑制Th2细胞分化使Th1/Th2平衡向Th1偏移[24]。

综上所述，固肾养阴汤有利于改善反复自然流产小鼠母胎界面免疫微环境，联合西药改善效果更佳，维持母胎界面Th1/Th2平衡的Th2型优势，调控SOCS1、SOCS3表达，利于胎儿免疫耐受，改善妊娠结局，为临床反复自然流产的防治提供理论基础。