黄雅兰，张艳玲，向 琴，喻 嵘，吴勇军，刘 秀

（1.湖南中医药大学 第一附属医院，湖南 长沙 410011；2.湖南中医药大学 中医学院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学 科技处，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学 研究生院，湖南 长沙 410208；5.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208）

左归降糖舒心方是湖南中医药大学陈大舜教授创立的中药复方，由人参（Panax ginseng C. A. Meyer）、黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge）、生地（Rehmannia glutinosa（Gaetn.）Libosch. ex Fisch. et Mey.）、葛根（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）、山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）、丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、麦冬（Ophiopogon japonicus（Linn. f.）Ker-Gawl.）、山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）9味中药组成，具有滋阴益气、活血解毒的功效，临床多用于糖尿病合并心血管疾病的治疗。本课题组的前期临床与实验结果显示，左归降糖舒心方可改善糖尿病合并冠心病、糖尿病合并心肌病患者的糖脂代谢异常，并改善心功能；可通过抗脂质过氧化对转基因2型糖尿病MKR鼠心肌产生保护作用［1］；体外实验表明，左归降糖舒心方含药血浆对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的J774A.1巨噬细胞泡沫化和细胞凋亡有明显的抑制作用［2］。虽然临床和实验研究表明左归降糖舒心方的疗效显著，但尚未对其化学成分进行系统全面分析，药效物质基础鲜有报道。

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）以灵敏度高、分辨率高、质量精度高等优点成为快速分离鉴定中药复方化学成分的有力工具。本研究采用该技术对左归降糖舒心方进行化学成分分析，可不依赖于实时质量轴校正，能长时间维持ppm 级的质量准度。实验样品经液相色谱分离后进行质谱检测，以高分辨质谱采集得到的一级和二级精确质量数为未知物鉴定最主要的信息，并通过数据依赖性采集模式获得高质量的二级质谱图。各个碎片亦具有超高质量精度，可以准确拟合出各碎片的化学式。本实验通过一级和二级质谱及相关中药数据库匹配，从左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出290 个化学成分，为进一步研究左归降糖舒心方的药效物质基础，指导临床合理用药以及后期实验研究提供了参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器及软件

Vanquish Flex 超高效液相色谱仪、Thermo Scientific™Q Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪、Heraeus Pico& Fresco 离心机（Thermo Fisher Scientific 公司）。定性分析软件：Compound Discoverer软件及Xcalibur qual browser（Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 药材与试剂

左归降糖舒心方组方药材购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，经湖南中医药大学药学院吴勇军教授鉴定为正品。将各味中药放于砂锅中以5倍蒸馏水浸泡1 h，加热煮沸后，转用文火煎煮20 min，纱布过滤药液，药渣再加3倍量蒸馏水煎煮20 min并过滤，将两次煎煮的滤液浓缩至含生药量为2 g/mL的药液，置于4 ℃冰箱保存备用。取15 mL中药水煎液高速离心，取上清液直接进样。

甲酸、乙腈（HPLC级，德国默克公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 Vanquish Flex超高效液相色谱系统由真空脱气机、自动进样器、柱温箱和二元泵组成。色谱柱为Xbridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.6µm，Waters公司）；流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。流速为0.3 mL/min，进样体积为10 µL，柱温为40 ℃。梯度洗脱程序如下：0 ～1.5 min，2% B；1.5 ～20 min，2% ～45% B；20 ～27 min，45% ～95% B；27 ～32 min，95% B；32 ～32.1 min，95%～2%B；32.1 ～35 min，2%B。

1.3.2 质谱条件 电喷雾电离源正、负离子（±ESI）检测模式，离子源参数如下：喷雾电压：+3.8 kV/-3.0 kV；鞘气压力：6 L/min；辅助气体压力：10 L/min；毛细管温度：300 ℃；加热器温度：450 ℃；S-Lens：50。质谱扫描参数：扫描范围m/z100 ～1 500；全质量分辨率（轨道阱分辨率）：70 000，MS/MS分辨率：17 500；碰撞能量：归一化碰撞能量：20、40、60。使用Xcalibur 4.3和Compound Discoverer 3.2化学工作站进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 左归降糖舒心方水煎液的化学成分分析

本实验利用Compound Discoverer 软件检索本地标准品自建二级质谱库，及网络数据库mzCloud、Chemspider和GNPS等对未知物进行鉴定，结合一级和二级质谱及数据库匹配，从左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出290种化学成分。图1为样品在正、负离子模式下的总离子流图。其中224个为已知的化学成分，包括黄酮类68 个、苯丙素类31 个、酚类26 个、皂苷类23 个、有机酸类20 个、生物碱类15 个、核苷类13 个、环烯醚萜类11 个、寡糖类4 个及13 个其它类型组分；66 个化合物为新发现的成分，主要为氨基酸/小肽类。所鉴定化学成分的保留时间、分子式、高分辨质谱母离子、碎片离子信息、成分类别、药材来源如表1所示。

图1 左归降糖舒心方在正（A）、负（B）离子模式下的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of Zuogui Jiangtang Shuxin formula in the positive（A）and negative（B）ion modes

表1 左归降糖舒心方化学成分的鉴定结果Table 1 Results of the chemical components of Zuogui Jiangtang Shuxin formula

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2.2 质谱分析

2.2.1 黄酮类 在左归降糖舒心方水煎液中鉴定出的黄酮类化合物数量最多，共68 种，主要来源于组方中的黄芪、葛根、山茱萸、丹参、山楂，包含黄酮、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮类、查尔酮等不同结构类型。以化合物148为例，从一级质谱图可见该成分的准分子离子峰为［M+H］+m/z417.117 7，拟合元素组成可知其分子式为C21H20O9；二级质谱图中可见丢失葡萄糖所得［M + H-C6H10O5］+m/z255.065 26 的特征碎片离子，此黄酮苷元进一步碎裂得到m/z199.075 42、181.064 76、137.023 44。该化合物鉴定为黄豆苷，为异黄酮类结构类型。

化合物177 从一级质谱图可见准分子离子峰为［M+H］+m/z465.102 8，拟合元素组成可知其分子式为C21H20O12；二级质谱图中可见丢失葡萄糖所得［M+H-C6H10O5］+m/z303.050 02 的特征碎片离子，此黄酮苷元进一步碎裂C2H2O3所得的碎裂离子m/z229.049 64，及C环RDA碎裂所得的m/z153.018 20。该化合物鉴定为槲皮素3-O-葡萄糖苷，为黄酮醇类结构类型。

化合物222 从一级质谱图可见准分子离子峰为［M+H］+m/z257.080 9，拟合元素组成可知其分子式为C15H12O4；二级质谱图中可见碎裂C6H6O2所得m/z147.044 05，碎裂C8H8O 所得m/z137.023 38，以及此两个碎片离子进一步碎裂C2O2分别所得的碎裂离子m/z91.054 24及81.033 54。该化合物鉴定为异甘草素，为查尔酮类结构类型。

2.2.2 氨基酸/小肽类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出66种氨基酸/小肽类化合物，小肽类物质可见逐步碎裂不同数目氨基酸的过程，最终可见氨基酸碎裂CO2和NH3的过程。以化合物5为例，其保留时间为0.931 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M+H］+m/z175.119 1，拟合元素组成可知其分子式为C6H14N4O2；二级质谱图中可见丢失CH3ON 所得m/z130.097 56 的碎片离子，丢失CH5N3所得m/z116.070 62的碎片离子，以及进一步碎裂所得的碎片离子m/z60.055 93和70.065 22。该化合物鉴定为DL-精氨酸。

2.2.3 苯丙素类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出31种苯丙素类化合物，主要来源于组方中的丹参、山楂。苯丙素类物质可见丢失不同数目的丹参素过程，低质量端可见特征碎片离子C6H6O2的结构单元。以化合物216 为例，其保留时间为12.709 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M-H］-m/z717.146 4，拟合元素组成可知其分子式为C36H30O16；二级质谱图中可见丢失1分子丹参素所得［M-HC9H10O5］-m/z519.093 44，及进一步丢失1分子丹参素所得［M-H-2C9H10O5］-m/z321.040 53的特征碎片离子，及［C6H6O2-H］-m/z109.029 46碎片离子。该化合物鉴定为丹酚酸B，碎裂机理如图2所示。

图2 丹酚酸B的质谱裂解途径Fig.2 The mass fragmentation pathways proposed for salvianolic acid B

2.2.4 酚类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出26 种酚类化合物，主要来源于组方中的丹参、黄芪、葛根。酚类物质主要经历碎裂脱水的过程，以化合物48 为例，其保留时间为2.764 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M-H］-m/z315.072 3，拟合元素组成可知其分子式为C13H16O9；二级质谱图中可见丢失1 分子葡萄糖所得［M-H-C6H11O5］-m/z152.011 47，及进一步丢失1 分子CO2所得［MH-C6H11O5-CO2］-m/z108.021 65的特征碎片离子。该化合物鉴定为龙胆酸-5-O-葡萄糖苷。

2.2.5 皂苷类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出23种皂苷类，主要来源于组方中的人参、黄芪。皂苷类物质主要经历不同数目糖碎裂的过程，高碰撞能量下苷元可发生进一步裂解。人参中皂苷类成分鉴定以峰262为例，其保留时间为18.803 min，从一级质谱图可见该成分的准分子离子峰为［M+H］+m/z947.556 3，拟合元素组成可知其分子式为C48H82O18；二级质谱图中可见丢失糖所得的苷元母核相关碎片离子m/z443.388 28、425.378 30、407.367 58，低质量端可见双糖的碎片离子C12H21O+10m/z325.113 37，及单糖的碎片离子C6H11O+5m/z163.060 21。此化合物鉴定为人参皂苷Rd，碎裂机理如图3所示。黄芪中皂苷类成分鉴定以峰259 为例，其保留时间为18.208 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M+H］+m/z785.467 8，拟合元素组成可知其分子式为C41H68O14；二级质谱图中可见丢失糖及水所得的苷元母核相关碎片离子m/z569.383 24，进一步脱糖所得的碎片离子m/z437.342 10，此外低质量端可见特征碎片离子m/z143.106 74。此化合物鉴定为黄芪甲苷。

图3 人参皂苷Rd的质谱裂解途径Fig.3 The mass fragmentation pathways proposed for ginsenoside Rd

2.2.6 丹参酮类 在左归降糖舒心方水煎液共鉴定出6 种丹参酮类化合物，来源于组方中的丹参药材。以化合物285 为例，其保留时间为24.250 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M + H］+m/z297.148 5，拟合元素组成可知其分子式为C19H20O3；二级质谱图中可见丢失CH3所得m/z282.125 18 的碎片离子，丢失H2O 所得m/z279.137 94 的碎片离子，以及进一步碎裂CO 分别所得的碎片离子m/z254.093 86和251.143 04。该化合物鉴定为隐丹参酮。

2.2.7 有机酸类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出20 种有机酸类成分，主要来源于组方中的山楂、山茱萸、人参。有机酸类物质主要是碎裂CO2和H2O 的过程，以化合物25 为例，其保留时间为1.243 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M-H］-m/z117.019 3，拟合元素组成可知其分子式为C4H6O4；二级质谱图中可见丢失H2O 所得［M-H-H2O］-m/z99.008 74，及丢失1 分子CO2所得［MH-CO2］-m/z73.029 49的特征碎片离子。该化合物鉴定为琥珀酸。

2.2.8 生物碱类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出15 种生物碱类成分，主要来源于组方中的黄连，生物碱类物质主要碎裂不同数目的CH4和CO，以及母核进一步碎裂。以成分214 为例，其保留时间为12.529 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为M+m/z336.122 7，拟合元素组成可知其分子式为C20H17NO4；二级质谱图中可见脱甲烷所得［M-CH4］+m/z320.091 92，进一步脱CO 所得［M-CH4-CO］+m/z292.096 92，及进一步碎裂CH2所得［M-CH4-CO-CH2］+m/z278.081 33。此化合物鉴定为小檗碱，碎裂机理如图4所示。

图4 小檗碱的质谱裂解途径Fig.4 The mass fragmentation pathways proposed for berberine

2.2.9 核苷类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出13种核苷类成分，主要来源于组方中的生地。核苷类物质主要经历糖碎裂的过程，以及碱基母核的进一步裂解，以化合物21为例，其保留时间为1.223 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M+H］+m/z268.104 2，拟合元素组成可知其分子式为C10H13N5O4；二级质谱图中可见丢失糖所得m/z136.061 75的碎片离子，进一步丢失NH3所得m/z119.035 20的碎片离子。该化合物鉴定为腺苷。

2.2.10 环烯醚萜类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出11种环烯醚萜类成分。该类物质主要经历糖碎裂的过程，以及母核碎裂CO2和H2O 的过程。以化合物94为例，其保留时间为6.149 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M-H］-m/z375.129 5，拟合元素组成可知其分子式为C16H24O10；二级质谱图中可见丢失1 分子葡萄糖所得［M-H-C6H10O5］-m/z213.077 00，及进一步丢失1 分子CO2所得［MH-C6H10O5-CO2］-m/z169.087 11的特征碎片离子。该化合物鉴定为马钱酸。

2.2.11 寡糖类 在左归降糖舒心方水煎液中共鉴定出4 种寡糖类成分，该类物质会发生不同数目的糖依次碎裂，最终单个糖环发生裂解。以化合物38 为例，其保留时间为2.137 min，从一级质谱图可见准分子离子峰为［M-H］-m/z341.108 7，拟合元素组成可知其分子式为C12H22O11；二级质谱图中可见碎裂1 分子糖所得［M-H-C6H10O5］-m/z179.056 21，进一步丢失H2O 所得m/z161.045 64 的碎片离子，及环碎裂所得的m/z89.024 44。该化合物鉴定为海藻糖。

本实验通过UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 技术，共鉴定出左归降糖舒心方中290 个化学成分，并对化合物的成分类别和来源进行归属。有24个化合物来源于黄芪，主要为黄酮类；15个来源于人参，主要为皂苷类；29个来源于生地，主要为核苷类；29个来源于葛根，主要为黄酮类；27个来源于山茱萸，主要为黄酮类；49个来源于丹参，主要为苯丙素类、黄酮类；16个来源于黄连，主要为生物碱类；7 个来源于麦冬，主要为皂苷类；45 个来源于山楂，主要为苯丙素类、黄酮类、有机酸类。在鉴定出的成分中，以黄酮类化合物数量最多，是左归降糖舒心方发挥疗效的重要物质基础。现代药理学研究表明，黄酮类化合物具有广泛的生物和药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗糖尿病和保护心脑血管等作用，对治疗糖尿病并发症非常有益［3］。

参考与人参、黄芪、生地、葛根、山茱萸、丹参、黄连、麦冬、山楂相关的文献［4-21］，结合氨基酸/小肽类的特征性裂解途径，本实验新发现了66 种氨基酸/小肽类化合物。小肽类化合物被认为是新一代生物活性调节剂，可防止细胞的氧化和炎症，预防糖尿病的发展［22］。

3 结 论

中药复方通常含有多种药材，成分非常复杂，其疗效来源于多种成分的综合作用。一种快速、高效、精确的化学成分鉴定方法对于复杂的中药复方非常重要。本研究结果表明，采用UHPLC-QExactive-Orbitrap-MS 技术可以快速并系统全面地对左归降糖舒心方中的化学成分进行定性分析，在一定程度上弥补了现阶段对左归降糖舒心方成分研究的不足，为左归降糖舒心方的质量控制及今后相关的实验研究奠定了基础。