侯秋苑，冯白茹，申 茹，梁 可，莫颖华，毛一中

(惠州卫生职业技术学院药学系，广东 惠州 516025)

理冲汤出自清末名医张锡纯所著《医学衷中参西录》上册，方中包含生黄芪、党参、白术、生山药、天花粉、知母、三棱、莪术、生鸡内金九味药，具有益气行血，调经祛瘀之功效[1]。经现代临床研究表明，理冲汤对子宫肌瘤、慢性盆腔炎、闭经、不孕症、卵巢早衰、多囊卵巢综合征等疾病[2-9]的疗效确切，不良反应较小，是临床常用的基础方。但理冲汤在临床应用中出现不便，如汤剂煎煮耗时，服用麻烦，不易携带和长时间储存等[10]，经检索发现目前国内外未见有关于理冲汤的提取工艺的研究报道，本实验采用单因素和正交试验等方法对理冲汤的提取工艺进行优选，以为后续实验提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-16高效液相色谱仪(岛津仪器有限公司)；KQ-250超声波清洁机(昆山超声仪器有限公司)；SHZ-D(III)型循环水真空泵(广州市星烁仪器有限公司)；BWS-20恒温水槽水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；TC-15套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂)；XS205分析天平(METTLER TOLEDO)。

1.2 试药

生黄芪(甘肃)、党参(甘肃)、白术(安徽)、生山药(河南)、天花粉(河北)、知母(安徽)、三棱(浙江)、莪术(广西)、生鸡内金(山东)均购自惠州市大参林药店有限公司。新芒果苷对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：190910，纯度≥98 %)；芒果苷对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：200116，纯度≥98 %)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：190716，纯度≥98 %)；乙醇(食用级，惠州市金利达贸易有限公司)；水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件

资生堂CAPCELL PAK C18 MG色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1 %磷酸(A)：乙腈(B)梯度洗脱(0 min～5 min，10 %B；5 min～10 min，10 %～12 %B；10 min～20 min，12 %～18 %B；20 min～30 min，18 %～26 %B；30 min～35min，26 %～33 %B；35 min～40min，33 %～55 %B；40 min～45 min，55 %～95 %B；45 min～47 min，95 %～50 %B；47 min～50 min，50 %～10 %B；50 min～55 min10 %B)；检测波长：260 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备

准确称取新芒果苷对照品10.6 mg、芒果苷对照品8.0 mg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷6.8 mg，置10 mL容量瓶中，用85 %乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，置4 ℃冰箱避光保存备用。

2.1.3 阴性样品溶液制备

取不含黄芪或知母的1/3处方量药材粗粉，85 %乙醇回流提取3次，每次1.5 h，过滤。

2.1.4 标准曲线的绘制

准确量取新芒果苷、芒果苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、对照品储备液，分别配置成720.8 μg/mL、360.4 μg/mL、180.2 μg/mL、90.1 μg/mL、45.05 μg/mL、22.53 μg/mL的新芒果苷对照品溶液，800.0 μg/mL、400.0 μg/mL、200.0 μg/mL、100.0 μg/mL、50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、10.0 μg/mL的芒果苷对照品溶液和26.15 μg/mL、13.05 μg/mL、6.528 μg/mL、3.264 μg/mL、1.632 μg/mL、0.816 μg/mL、0.408 μg/mL、0.204 μg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液。准确吸取上述溶液10 μL，按上述色谱条件进样行测定，以质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行回归。

2.1.5 专属性试验

精密吸取对照品溶液、理冲提取溶液和阴性样品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样，记录。

2.2 醇提工艺

2.2.1 提取方法考察

①回流提取法[10]：称取1/3处方量(生黄芪9 g、党参6 g、白术6 g、生山药15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪术9 g、生鸡内金9 g)药材粗粉，用10倍量体积分数为85 %的乙醇回流提取1次，每次1 h，滤过。

②超声辅助提取法[10]：称取1/3处方量药材粗粉，用10倍量体积分数为85 %的乙醇，超声1 h，滤过。

③冷浸法[10]：称取1/3处方量称取1/3处方量药材粗粉用10倍量体积分数为85 %的乙醇，浸渍48 h，滤过。

④将上述滤液进样测定，因黄芪为方中主药，评分时设置毛蕊异黄酮葡萄糖苷的权重为0.5，新芒果苷、芒果苷为0.25。计算综合评分。

2.2.2 溶剂浓度的考察

按1/3处方量称取理冲汤药材粗粉，分别用体积分数为55 %、65 %、75 %、85 %、95 %的乙醇对药材进行回流提取，C(mL/g)=V乙醇∶m药材=10∶1，80 ℃水浴1 h，过滤取滤液，进样测定。

2.2.3 正交试验

本实验采用体积分数为85 %的乙醇为提取溶剂，采用回流提取法提取理冲汤中的有效成分。通过文献研究[10-11]和预试验，发现提取时间(A)、提取次数(B)及液固比(C)三个因素对提取效率影响较大，根据生产需要，以综合评分为评价指标，按L9(34)表正交试验，因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.3 水提工艺

参考相关文献[11]，取醇提后药渣，以液固比(A)、提取时间(B)及提取次数作为因素，以干膏率为评价指标，按L9(34)表正交试验，因素水平见表2。

表2 因素水平表

3 结果

3.1 标准曲线与专属性

新芒果苷、芒果苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性结果见表3，专属性考察结果见图1。由此可得，三个对照品在各自范围内的线性关系较好，分离度高，阴性结果无干扰。

表3 线性关系考察结果

A.对照品；B.供试品；C.知母阴性样品；D.黄芪阴性样品1.新芒果苷(Neomangiferin)；2.芒果苷(Mangiferin)；3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷(Calycosin-7-glucoside)图1 专属性考察结果

3.2 醇提工艺

3.2.1 提取方法和提取溶剂

提取方法结果见表4，提取溶剂浓度考察结果见表5，结果表明回流提取法的综合评分远高于另两种方法，体积分数为85 %的乙醇提取效果最佳，故本实验选择回流提取法为理冲汤的提取方法，体积分数为85 %的乙醇为提取溶剂。

表4 提取方法考察结果

表5 溶剂浓度考察结果

3.2.2 正交试验

正交试验结果见表6，方差分析见表7。由表6可以看出，影响提取效果的各因素大小顺序为：B>A>C，即提取次数的影响程度最高，共次是提取时间，最小的是液固比影响；由表7可知，提取次数、提取时间及液固比对综合评分均没有显著性影响。优选最佳条件是提取条件应为A3B3C1，即每次提取1.5 h，提取3次，液固比8：1。将处方量药材放大5倍[12]，按优化工艺进行回流提取，进行3批验证试验，结果表明该工艺稳定可行。

表6 正交试验方案及结果

表7 方差分析

3.3 水提工艺

正交试验结果见表8。影响提取结果的因素顺序为：C>B>A，即提取次数的影响程度较大，提取时间第二，液固比影响最小。优选提取条件应为A3B3C3，但是A、B因素中的k3和k2相差甚小，从节省资源的角度考虑，选择最优提取工艺条件为A2B2C3，即液固比10：1，每次提取1 h，提取3次。将处方量药材放大5倍，按优化工艺进行水煎煮，进行3批验证试验，结果表明该工艺稳定可行。

表8 正交试验结果与分析

4 讨论

理冲汤由生黄芪、党参、白术、生山药、天花粉、知母、三棱、莪术、生鸡内金九味药组成，研究[12]-[16]表明知母中含有的新芒果苷具有抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗炎及抗肿瘤等药效、芒果苷具有降血糖、抗炎、抗肿瘤、抑菌等药理作用，而黄芪药材中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有明显的抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抑制黑色素形成和免疫调节活性等作用，均与理冲汤治疗子宫肌瘤、慢性盆腔炎等疾病相关，故本实验选择新芒果苷、芒果苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为理冲汤提取工艺的评价指标，经前期预实验发现上述三种成分在醇提物的含量远高于水提物，且有文献说明[17-18]莪术乙醇提取物、三棱中的黄酮类成分具有抗肿瘤作用，选择先对理冲汤的醇提工艺进行了优选，优选的最佳方案是以体积分数为85 %的乙醇为提取溶剂，每次提取1.5 h，提取3次，液固比8：1。

另有研究[19]-[25]表明理冲汤处方中的九种药材大多数含有多糖、氨基酸、微量元素等成分，多糖类成分多具有抗肿瘤作用，而多糖类成分多用热水浸提法提取，且上述文献也表明方中各药材的水提物还具有增强免疫活性、降糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎等作用，因此本实验选择醇提后再继续水提，以出膏率为评价指标将理冲汤中的有效成分尽可能地提取出来，最后优选的水提工艺为每次提取1 h，提取3次，液固比10：1。