●彭 华 张式一 何 莉

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，发病机制尚未十分明确，肺癌的发生发展对人们的健康造成严重的威胁。大多数肿瘤因缺乏有效的早期诊断手段，当被查出时大多发生了转移并发展到中晚期，错过了最佳的治疗时机，导致病人的存活率下降。那么早期发现、早期诊断、早期治疗显得非常重要[1]。循环游离DNA是一种灵敏度高、特异性强的分子标志物用于肿瘤的检测和预后检测，因此需要灵敏度高和特异性好易操作的方法来提高检出率。应用外周血游离DNA样本的检测是近年来新兴的肿瘤诊断技术，其呈现出取材方便、容易检测及非侵入性等诸多优势[2]，有利于临床指导早期诊断，本研究拟采用SNP敏感性分子开关[3]技术对肺癌ATM基因rs175048、rs227060两位点多态性进行检测，为进一步提高肺癌早期诊断效果，为肺癌早期预警和发病风险评估提供理论基础。

一、材料与方法

1.材料。本研究纳入2021年10月到2022年3月收集衡阳地区某医院样本，在患者知情同意下，采集肺癌患者血液120例，男76例，女44例，正常对照组为健康人群120例，男60例，女60例。非小细胞肺癌98例，小细胞肺癌22例，所有患者均为原发性肺癌，患者年龄均在45～79岁之间。

2.实验方法。采集外周静脉血2ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，使用上海天根生物工程有限公司提供的试剂盒，提取外周血游离DNA，-20°保存。采用SNP敏感性分子开关（on-off switch）技术对两位点进行基因分型检测，引物设计：rs175048A/T 正向引物 1(F1)5’-TGCCTAGAAAATAAGCTA-3’，正向引物 2(F2)5’TGCCTAGAAAATAAGCAA-3’,反向引物(R)5’-TCAACACTGCATTACCTC-3’；rs227060C/T 正向引物 1(F1)5’-AATACTCAAAAGCTTCTC-3’，正向引物 2（F2）5’-AATACT CAAAAGCTTCTT-3’，反向引物（R）5’-TACTTCCATTATTTCTT G-3’。所有引物均由上海生物工程公司合成。聚合酶链反应体系（PCR）：采用25ul反应体系，包括模板外周血游离DNA 1.5ul、正反向引物各1ul、公共引物1ul、去离子水9ul、2*Pfu Mix 12.5ul。反应条件:94℃预变性3min,94℃变性30s,55℃退火30s，72℃延伸30s,共35个循环,最后 72℃延伸 5min，取PCR产物5ul用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳。

二、结果

1.提取外周血游离DNA。将收集的肘正中静脉血采用外周血游离DNA试剂盒提取游离DNA，用紫外分光光度计测量其浓度，浓度均在1.7～2.0之间，然后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测游离DNA的质量，条带清晰，无杂带。检测完剩余的DNA保存于-20°备用。见图1。

图1 外周血游离DNA琼脂糖凝胶电泳结果

2.SNP敏感性分子开关技术对ATM基因rs175048、rs227060两位点检测。采用SNP分子开关技术对ATM基因rs175048、rs227060两位点进行检测分型，根据PCR产物有和无的现象，进行特异性扩增，扩增得到目的片段，PCR产物长度分别为167bp和331bp。rs175048位点F1为野生模板检测引物，F2为突变模板检测引物，结果发现AA纯合子电泳后只出现与F1配对的1个目的片段，TT纯合子只出现与F2配对的1个目的片段，然而AT杂合子则出现与F1、F2配对的2个目的片段。纯合子AA（25例）、TT（38例）、杂合子AT（57例）；rs227060位点F1为野生模板检测引物，F2为突变模板检测引物，结果发现CC纯合子电泳后只出现与F1配对的1个目的片段，TT纯合子只出现与F2配对的1个目的片段，而CT杂合子则出现与F1、F2配对的2个目的片段。纯合子CC（44例）、TT（14例）、杂合子 CT（62例）；在肺癌样本检测中发现杂合子检出率明显高于纯合子。

三、讨论

血液中游离DNA是一种游离于细胞外的DNA，多种病理状态下血中游离DNA的水平和组成会发生改变。目前多数研究表明肿瘤患者外周血液DNA水平不仅明显高于正常人[4-5]，且血液游离DNA具有与肿瘤组织DNA一致的基因改变类型[6-7]。血液游离DNA产生的生物学机制较为复杂，除正常细胞的衰老死亡之外，主要来源于肿瘤细胞坏死凋亡后扩散以及增生活跃肿瘤细胞的释放。随着肿瘤分子生物学的深入研究，血液游离DNA结合各类分子生物学检测技术被认为是肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段。

目前世界范围内检测基因位点突变的方法多种多样，主要有DNA序列分析、PCR扩增线粒体DNA片段、限制性内切酶分析、变性高压液相色谱分析，SNP突变敏感性分子开关技术是一种快速、灵敏、经济、高效、可靠的突变检测方法，具有典型特点：（1）耗时费力少，整个DNA提取；（2）检测成本低，经济实用；（3）检测程序简单，不需要专门专业人员操作；（4）该技术表现配对引物被延伸，不配对引物不延伸的有或无的二元化效果。

本研究拟采用SNP敏感性分子开关技术对120例肺癌患者ATM基因rs175048、rs227060多态性位点检测，结果显示rs175048位点共检测出AA、AT、TT三种基因型，其中AT基因型检出率57例；rs227060位点共检测出CC、CT、TT三种基因型，其中CT基因型检出率62例，发现杂合子检出率明显高于纯合子。然而有学者研究发现[8]，杂合子是肿瘤患者基因型中常见的现象，与本研究结果相符，针对肺癌ATM抑癌基因rs175048、rs227060两位点杂合子检测发现，在循环游离DNA中检测杂合子可作为肺癌患者的预后判定指标，为肺癌早期预警和发病风险评估提供理论基础，可作为判断肺癌患者的病情变化和诊断的良好辅助指标，此方法可广泛应用于临床。