庄慧宇，张志强，王 维，瞿 红，娄 彤，朱连成，刘娟娟，刘大我，林 蓓，王淑珍

人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），又名乳清酸性蛋白，最早发现在人附睾中表达[1]，有研究证明，HE4不仅在卵巢癌中高表达，在子宫内膜癌、肺腺癌等恶性肿瘤中也均有较高表达[2]。2005年有研究证实HE4是一种分泌性糖蛋白[3]。细胞膜上广泛表达的糖基抗原是糖蛋白的重要组成部分，其改变与细胞的恶变、增殖、侵袭及转移等生物学特性有着密切的联系。岩藻糖广泛参与各种糖链的构成，Lewis聚糖是岩藻糖化的乳糖系列聚糖，根据其糖链结构不同分为Lewis y、Lewis x、Lewis a、Lewis b、sLewis a和sLewis x。和唾液酸类似，一般认为岩藻糖是糖链合成的终末残基，接上岩藻糖基后，该糖链就不再继续合成。岩藻糖糖链结构改变与某些肿瘤细胞的恶性行为有关[4]。前期研究证明，卵巢恶性肿瘤细胞和组织中的HE4上均有Lewis y抗原的表达[5]，本实验通过检测多种上皮性肿瘤细胞中HE4表面岩藻糖基化抗原的表达，证明HE4表面岩藻糖基化修饰的普遍性，并证明卵巢癌细胞中HE4上的Ⅱ型糖链的表达明显高于Ⅰ型糖链。

1 材料与方法

1.1 细胞系来源 OVCA R-3、SKOV-3、ES-2及CaoV-3（卵巢癌细胞系），A549（肺癌），MCF7（乳腺癌），AsPC1（胰腺癌）和 HT-29（结肠癌）均购买于上海细胞库。OVCAR-3、SKOV-3、ES-2、HT29在加了10%血清的McCoy's 5A（Invitrogen）培养基中培养。CaoV-3、AsPC-1使用1640（Hyclone）培养基，A549、MCF7使用 DMEM（Hyclone）培养基。

1.2 方法 首先选择了高度表达HE4蛋白的卵巢癌和肺腺癌细胞、中度表达的乳腺癌和胰腺癌细胞以及低表达HE4的结肠癌细胞进行研究。利用Western blot、免疫细胞化学以及Real time PCR分别检测了上述8种细胞中HE4和Lewis y的表达。为了进一步探讨HE4表面是否还存在其他岩藻糖基化修饰，利用免疫共沉淀以及激光共聚焦对上述8种细胞进行检测。

1.2.1 免疫细胞化学 用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞，在含10%胎牛血清的培养基中培养，并制成单细胞悬液。冷PBS洗涤细胞2次，4%甲醛固定30 min。兔抗人HE4抗体（Abcam，单克隆抗体）工作浓度为1：300和鼠抗人Lewis y抗体（Abcam，单克隆抗体）工作浓度为1：100。染色方法按SABC试剂盒说明书进行。阴性对照由磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。

1.2.2 实时定量PCR 按照说明书使用Trizol（Invitrogen）提取总RNA。取RNA 2 µl按照说明书合成cDNA（宝生物工程有限公司，中国）。SYBR Green RT-qPCR引物序列如下：人HE4：F：5'-AGTGTCCTGGCCAGATGAAATG-3'；R：5'-CAGGTGGGCTGGAACCAGAT-3'。FUT1：F：5'-TGGTTGGGAAAGGGAGAA-3'；R：5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'。GAPDH：F：5'-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3'；R：5'-CGC CCCACTTGATTTTGG-3'。应用Light Cycler PCR 检测系统（罗氏诊断产品公司，德国）按说明书进行Real-time PCR（宝生物工程有限公司，中国）扩增并检测Ct值。目的基因表达倍数的改变利用2-ΔΔCT法进行计算。2-ΔΔCT结果大于1.4或者小于0.6被认为是有意义的。

1.2.3 免疫共沉淀 分别收集上述各种细胞，4 ℃裂解30 min，15 000 rpm离心30 min后取上清。上清中加入5 μg抗HE4抗体（Santa Cruz，山羊抗人多克隆抗体），4 ℃孵育过夜后，加入20 μl ProteinA/G PLUSAgarose（Santa Cruz），4 ℃，3 h。3 000 rpm离心5 min，1 ml裂解液洗涤沉淀，重复3次。免疫沉淀物变性后在Western Blot方法中分别用HE4抗体（Abcam，兔抗人单克隆抗体）和Lewis y抗体（Abcam，鼠抗人单克隆抗体）、Lewis x抗体（Santa Cruz，鼠抗人多克隆抗体）、saily Lewis x抗体（Lifespan，鼠抗人单克隆抗体）、Lewis a抗体（Abcam，鼠抗人单克隆抗体）、Lewis b抗体（Abcam，鼠抗人单克隆抗体）、saily Lewis a抗体（Millipore，鼠抗人单克隆抗体）检测。ECL（Amersham）发光试剂发光。

1.2.4 激光共聚焦法 选取CaoV-3细胞，切片制作方法同免疫细胞化学。采用免疫荧光双标记法，每张切片中一抗同时加入HE4和Lewis y抗体，同时设磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作空白对照片。兔抗人HE4和鼠抗人Lewis y抗体工作浓度均为1∶100，山羊抗兔IgG TRITC、山羊抗鼠IgM FITC的工作浓度为1∶100，2种一抗和二抗均按1∶1均匀混合加入标本中。染色方法按免疫荧光试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，计数资料以表示，采用χ2检验及Fisher确切概率检验，2组间比较进行t检验，多组间比较采用方差分析，相关分析采用χ2检验，分析密切程度用Pearson列联系数C和直线回归相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各种肿瘤细胞中HE4和Lewis y的表达情况 结果发现，8种细胞中均有HE4和Lewis y抗原，且Western blot（图1A、B）、免疫细胞化学（图1C）以及Real time PCR（图1D）结果一致，卵巢癌细胞系（OVCZR-3，SKOV-3，ES-2，CaoV-3）和肺腺癌细胞（A549）中的HE4表达相对较高，高于乳腺癌（MCF7）和胰腺癌细胞（AsPC1）的表达，结肠癌（HT-29）中HE4的表达量最低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1B）。但Lewis y的表达量在各种细胞中高低不一，可能与多种肿瘤相关蛋白表面均有Lewis y结构有关。免疫细胞化学可以发现：HE4染色呈棕黄色颗粒或淡黄色颗粒，主要分布于胞浆，胞膜和核周也可见着色；Lewis y抗原也呈阳性表达，广泛分布于胞膜和胞浆（图1C）。

图1 HE4和Lewis y抗原在多种肿瘤细胞中的表达

2.2 各种肿瘤细胞中HE4与Lewi s抗原的共表达情况 免疫共沉淀提示，8种细胞HE4表面均有Lewis y、Lewis x、sLewis x、Lewis a、Lewis b、sLewis a的表达，但同种细胞中Ⅱ型糖链Lewis y、Lewis x、sLewis x的表达明显高于Ⅰ型糖链Lewis a、Lewis b、sLewis a（图2）。激光共聚焦也均检测到8种细胞中HE4和Lewis抗原的共定位，但HE4和Lewis y抗原之间的共定位最明显，尤其在卵巢癌细胞株中（部分结果未显示）：在卵巢癌细胞OVCAR3中，HE4主要定位于细胞膜和细胞浆；Lewis y抗原也主要定位于细胞膜和细胞浆。两通道合成后的图像中，同时发出红光和绿光的位置见到黄色荧光发出，证明HE4与Lewis y抗原存在共定位关系（图3）。

图2 免疫共沉淀检测HE4及Lewis抗原在多种肿瘤细胞中的共表达情况

图3 激光共聚焦检测卵巢癌细胞CaoV-3中HE4及Lewis y抗原共定位情况表达情况

3 讨论

Lewis y抗原是含有双岩藻糖的寡糖，研究发现75%的上皮性卵巢癌中有Lewis y不同程度的过量表达，且表达增高的患者预后不佳[6]。除了上皮性卵巢癌肿瘤标志物CA125和MUC-1的分子结构中含有Lewis y抗原[7]外，还发现，最新的上皮性卵巢癌肿瘤标志物HE4上也存在Lewis y抗原结构[5]。同时，课题组前期研究还证实了表皮生长因子受体、整合素α5β1、CD44等糖复合物表面也存在Lewis y抗原结构[8-9]。前期研究证明，肿瘤细胞表达的Lewis y抗原通过改变相应受体信号转导通路磷酸化水平，参与许多细胞功能，影响细胞的恶性行为，包括粘附、识别和信号转导等，Lewis y抗原增加有利于肿瘤细胞的侵袭和播散[5]。

本研究对多种肿瘤细胞HE4表面的岩藻糖基化修饰进行检测。结果发现HE4的岩藻糖基化修饰不仅发生在卵巢癌，在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等细胞系中也检测到HE4的岩藻糖基化修饰。本研究还证明了HE4上不仅存在Lewis y抗原修饰，还检测到Lewis x、Lewis a、Lewis b、sLewis a和sLewis x的结构。在不同细胞系中这种修饰存在量的差异，但是在同一细胞系中Lewis y、Lewis x、sLewis x等乳糖系列Ⅱ型糖链的修饰明显高于Lewis a、Lewis b、sLewis a等Ⅰ型糖链表达，这可能与细胞系中a1，2-岩藻糖转移酶基因高表达相关。

本课题组前期研究发现，CaoV-3、SKOV3卵巢癌细胞系的转移和侵袭能力均较ES-2和OVCAR3强（P＜0.05）[9]，同时免疫共沉淀结果证明Caov-3、SKOV3细胞中HE4上Lewis y抗原的相对量也高于ES-2和OVCAR-3，而Lewis x抗原的相对量却低于ES-2和OVCAR-3，说明转移和侵袭能力强的细胞中的Lewis x抗原继续被糖基化，多以Lewis y形式存在，而Lewis y抗原为双岩藻糖比Lewis x对基质的粘附性更强。为了进一步证实Lewis y抗原对HE4介导的卵巢癌细胞侵袭和转移能力的影响，选择了HE4上Lewis y抗原相对表达高的CaoV-3细胞和Lewis x抗原相对表达高，但Lewis y抗原相对表达低的细胞ES-2进行研究。通过转染HE4后，2种细胞中HE4、Lewis y及HE4上的Lewis y的表达均增高，且转染后2种细胞的侵袭和转移能力较前均增强，特别是ES-2细胞变化更为明显，Lewis y抗体阻断实验证明，其转移能力6 h开始明显减弱，侵袭能力24 h明显减弱，结果证明HE4上Lewis y的过表达明显促进了卵巢癌细胞的侵袭和转移[8-9]。

在前期的研究中证实了HE4表面Lewis y抗原的过表达促进了卵巢癌细胞的侵袭和转移，Lewis y抗体阻断后，侵袭和转移能力明显下降[5，8-9]。但是否还有其他相关蛋白或通路参与了Lewis y介导的卵巢癌的侵袭和转移，HE4上Lewis y抗原的过表达是否影响了卵巢癌细胞的增殖、耐药、自噬等其他生物学行为；肺癌、乳腺癌、结肠癌等其他多种恶性肿瘤细胞HE4表面岩藻糖基化的修饰是否也像卵巢癌一样，是否影响了侵袭、转移等相关的恶性生物学行为，需要进一步研究。另外，近年来，以Lewis y作为靶分子，成功研制的多种含有Lewis y的抗肿瘤药物[10]，为恶性肿瘤的治疗开辟了广阔的前景。对于FDA批准的监测上皮性卵巢癌的复发和进展的肿瘤标志物HE4[2]，其表面过表达的Lewis y抗原，是否可以作为识别HE4的标志，从而成为临床治疗的新靶点，为预防和治疗卵巢癌提供了一个新的途径，值得进一步探讨。