廖辉，吴琼，焦龙，甄祖刚，杨文腰，周荔葆

辽宁成大生物股份有限公司，辽宁沈阳 110179

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒引起的人畜共患性传染病，全球每年死于狂犬病的人数约5.9 万，是致死人数较多且威胁公共卫生的动物源性传染病［1］。接种狂犬病疫苗是防治人患狂犬病唯一有效的方法。我国每年狂犬病疫苗接种量可达1 500 万人份［2］。

目前，国内人用狂犬病疫苗生产用毒株主要包括CTN-1V、aG 和PV2061 株［3］。人用狂犬病疫苗（二倍体细胞）（human diploid cell vaccine，HDCV）是由法国巴斯德研究所首次报道，具有较好的免疫原性和安全性［4］。本文旨在研究狂犬病病毒固定株PV2061 在人二倍体MRC-5 细胞上的适应性传代，观察不同代次病毒感染特性，比较不同稀释度下病毒的病毒滴度和收获时间，确定最佳传代工艺，通过对病毒液纯化工艺的优化，为疫苗生产工艺的优化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1毒种及细胞 狂犬病病毒固定株PV2061 来源于本公司Vero 细胞适应株，原始毒株由美国CDC提供；MRC-5 细胞由ATCC 提供。

1.2实验动物 SPF 级昆明小鼠，3 周龄，雌雄各半，体重11 ~ 13 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：43004700008361。本实验均以科研为目的对实验动物进行养殖和使用，且按照2006 年9 月13 日科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中动物伦理相关规定进行（国科发财字［2006］398 号）。

1.3主要试剂及仪器 L-15 培养基和胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；新生牛血清购自兰州荣晔生物科技有限责任公司；狂犬病病毒抗原含量检测用荧光抗体购自NIBSC，自行包被；牛血清残留量检测试剂盒购自无锡博生医用生物公司；层析系统购自美国GE 公司；超滤系统购自美国Millipore 公司；酶标仪购自美国Thermo 公司。

1.4狂犬病病毒在人二倍体细胞上的适应性传代将狂犬病病毒固定株PV2061 以1 ∶1 000 稀释度感染MRC-5 细胞进行连续性传代。感染后于37 ℃培养3 ～4 d，待细胞基本铺满平面后更换病毒培养液，于35 ℃培养，每隔3 ～4 d 换液1 次，细胞病变率达80%以上收获，为1 代。按上述相同方式从第2 代（MPV2）连续传至第24 代（MPV24），取样检测病毒滴度。

1.5感染剂量（MOI）对病毒增殖影响的检测 取第11 代狂犬病病毒悬液，分别按1 ∶100、1 ∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500 MOI 接种于MRC-5 细胞，考察不同MOI 对病毒增殖的影响。感染后于37 ℃培养3 d，更换病毒培养液，于35 ℃继续培养，每隔3 ～4 d 换液1 次，细胞病变率达80%以上收获。取样检测3 批收获液的病毒滴度。试验重复2 次。

1.6不同收获天数对病毒增殖影响的检测 取第11 代狂犬病病毒悬液，接种于MRC-5 细胞，37 ℃培养3 d，更换病毒培养液，35 ℃继续培养，分别取4、7、10、13、16 d 的病毒培养物，检测病毒滴度。对不同天数病毒培养物进行荧光染色，观察荧光反应。

1.7感染方式对病毒增殖影响的检测 取第11 代狂犬病病毒悬液，分别考察混种感染、吸附感染及带毒传代3 种感染方式对病毒增殖的影响。选择第26 代MRC-5 细胞，混种感染方式同1.4 项；吸附感染：待细胞铺满单层后，吸附病毒，于37 ℃放置1 h，再加入病毒培养液，于35 ℃培养，每隔3 ～4 d换液1 次，细胞病变率达80%以上收获；带毒传代：在混种感染基础上于37 ℃培养3 d 后再次进行细胞1 ∶2 或1 ∶4 传代，37 ℃继续培养3 d，更换病毒培养液，于35 ℃培养，每隔3 ～4 d 换液1 次，细胞病变率达80%以上收获。取样检测3 批收获液的病毒滴度。试验重复2 次。

1.8不同层析介质对狂犬病病毒纯化效果影响的检测 取3 批狂犬病病毒收获液（20141001-1、2014-1003-2、20141201-3），经超滤浓缩、灭活等后，分别用层析介质Sepharose 4FF 和Sepharose 6FF 进行柱层析纯化，上样量不超过柱床体积的15%，在280 nm下收集样品，检测抗原含量、总蛋白质及牛血清白蛋白残留量，分析不同层析介质对狂犬病病毒收获液纯化效果的影响。

1.9病毒滴度检测 按照《中国药典》三部（2010版）病毒滴度检测方法进行。选择10-3、10-4、10-53个稀释度经脑内接种小鼠，每个稀释度接种6 只，0.3 mL ／ 只。逐日观察，3 d 内死亡者不计（死亡数量应不超过试验动物总数的20%），观察14 d。病毒滴度应不低于6.0 lgLD50／ mL。

1.10抗原含量及回收率测定 采用ELISA 试剂盒检测狂犬病病毒抗原含量，在波长492 nm 处测定吸光度值。根据柱层析前后总抗原含量的比值计算回收率。

1.11总蛋白质含量检测 采用Lowry 法。按照《中国药典三部（2010 版）蛋白质含量检测方法进行，在波长650 nm 处测定吸光度值。

1.12牛血清白蛋白残留量检测 采用定量牛血清白蛋白ELISA 试剂盒，于波长450 nm 处测定吸光度值。狂犬病病毒纯化液中牛血清白蛋白残留量应不高于50 ng ／ mL。

2 结 果

2.1狂犬病病毒固定株PV2061 在MRC-5 细胞上连续性传代的适应性 狂犬病病毒固定株PV2061对MRC-5 细胞有较好的适应性，初始病毒滴度为5.28 lgLD50／ mL。从第4 代开始，随着传代次数的增加，病毒滴度液逐渐升高，在第11 ～19 代之间病毒滴度达6.50 lgLD50／ mL 以上，稳定在6.50 ～7.50 lgLD50／ mL 之间，表明该固定株已完全适应于MRC-5 细胞。见表1。

表1 狂犬病病毒固定株PV2061 在MRC-5 细胞上连续性传代的病毒滴度（lgLD50／ mL）Tab.1 Virus titers of rabies virus fixed strain PV2061 subcultured continuously in MRC-5 cells（lgLD50／ mL）

2.2MOI 对病毒增殖的影响 1 ∶100、1 ∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500 MOI 的狂犬病病毒固定株PV2061 感染MRC-5 细胞后，病毒滴度均值分别为6.64、6.60、6.40、6.52 和6.60 lgLD50／ mL，均高于6.20 lgLD50／ mL，且3 个批次间差异较小。表明感染剂量在1 ∶100 ～1 ∶500 之间病毒增殖无明显差异。见表2。

表2 不同MOI 下的病毒滴度（lgLD50／ mL）Tab.2 Titers of virus inoculated at various MOIs（lgLD50／ mL）

2.3不同收获天数对病毒增殖的影响 4、7、10、13、16 d 病毒培养物的滴度分别为2.69、6.14、6.52、7.02 和3.62 lgLD50／ mL，随着培养天数的增加，病毒滴度呈上升趋势，在第13 天达峰值，然后急剧下降。荧光染色结果显示，从第4 天开始，细胞逐渐产生病变，荧光反应也逐渐增强，尤其在7 ～16 d 之间，见图1，与病毒滴度检测结果基本相符。

图1 不同收获天数病毒培养物的荧光染色结果（× 200）Fig.1 Fluorescence staining of virus cultures harvested on different days after inoculation（× 200）

2.4感染方式对病毒增殖的影响 吸附感染3 批收获液病毒滴度均值分别为4.28、5.15 和5.12 lgLD50／mL，混种感染3 批收获液病毒滴度均值分别为6.44、5.63 和5.87 lgLD50／ mL，带毒传代3 批收获液病毒滴度均值分别为5.97、6.77 和5.73 lgLD50／ mL，不同批次间差异较小，表明混种感染和带毒传代对狂犬病病毒增殖优于吸附感染。见表3。

表3 不同感染方式下收获液的病毒滴度（lgLD50／ mL）Tab.3 Titers of harvested virus fluids infected by different modes（lgLD50／ mL）

2.5不同层析介质对狂犬病病毒纯化效果的影响层析介质Sepharose 4FF 和Sepharose 6FF 纯化的3批抗原平均回收率分别为85.68%和87.37%，均在85%～120%范围内；总蛋白质去除率分别为88.76%和80.89%，Sepharose 4FF 明显优于Sepharose 6FF；牛血清白蛋白残留量均低于50 ng ／ mL。见表4。

表4 不同层析介质纯化后3 批狂犬病病毒抗原回收率、总蛋白质及牛血清白蛋白去除效果Tab.4 Antigen recoveries as well as removal rates of total protein and BSA of three batches of rabies virus purified with different chromatographic media

3 讨 论

目前国内已授权上市的狂犬病疫苗主要为鸡胚细胞狂犬病疫苗［5］、Vero 细胞狂犬病疫苗［6-7］、仓鼠肾细胞狂犬病疫苗［8］和HDCV［9］。但狂犬病疫苗（Vero 细胞）总不良反应发生率为30.5%，高于HDCV的1.5%，尤其对于孕妇和婴幼儿来说，选择更具有安全性和有效性的狂犬病疫苗十分重要［10］。FAYAZ等［11］对注射了5 针HDCV 的26 人进行跟踪研究，在32 年后随访时发现，绝大部分人中和抗体水平仍有保护性，加强免疫注射后，中和抗体水平在2.6 ～20 IU ／ mL 之间。

影响狂犬病疫苗接种后效果的因素很多，其中最主要的是疫苗效价。影响疫苗效价的因素包括毒株对宿主细胞的适应性、生产时宿主细胞状态、病毒MOI、病毒接种时间、培养时间及培养温度等，而毒株对宿主细胞的适应性是影响病毒产量的重要因素之一。因此，对毒株的筛选及适应性传代对整个疫苗工艺来说至关重要。

选择MRC-5 细胞为狂犬病病毒固定株PV2601的宿主载体，经连续性传代后，获得培养特征明显、稳定的细胞适应株（MPV2061），第11 ～19 代病毒滴度均在6.20 lgLD50／ mL 以上，通过对MOI、感染方式和培养天数的优化初步建立了MPV 株在MRC-5 细胞上的培养条件，对收获及纯化工艺的研究为狂犬病疫苗生产提供了试验数据。

固定株PV2061 在MRC-5 细胞上适应性传代过程中，初步评估了MOI 和收获天数对病毒增殖的影响，结果表明，MOI 在1 ∶100 ～1 ∶500 范围内，病毒滴度均值均高于6.0 lg LD50／ mL；收获天数在10 ～13 d，病毒滴度均高于6.5 lg LD50／ mL，在第13 天达峰值，然后急剧下降至3.62 lgLD50／ mL。

病毒培养条件研究主要对感染方式和收获方式进行了初步探讨。对比发现，混种感染（6.44 ／5.63 ／ 5.87 lgLD50／ mL）和带毒传代（5.97 ／ 6.77 ／5.73 lgLD50／ mL）有利于病毒在细胞体内增殖，病毒滴度明显高于吸附感染（4.28／5.15／5.12 lgLD50／mL）。分批收获从第7 天开始，分别于7、10、13 d 共计收获3 次，第4 次收获液病毒滴度无法检测，均值为6.10 lgLD50／ mL，而连续收获能收获16 d，第7 ～9天，病毒滴度检测均较低，第10 ～16 天，收获液病毒滴度均高于5.0 lgLD50／mL，均值为5.30 lgLD50／mL。

综上所述，本研究采用Vero 细胞适应株PV2061在MRC-5 细胞上进行连续性传代，优化了MOI、感染方式及收获天数等培养条件，以及感染后收获方式。结果表明，获得的狂犬病病毒二倍体细胞适应株MPV2061 检测结果符合《中国药典》三部（2010版）要求，为后续人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）的研发提供了数据支持。