吴 斌，夏年红

(安徽卫生健康职业学院基础部，安徽 池州 247099)

由于不合理的饮食习惯和生活方式导致一系列代谢相关疾病的极速增长，如肥胖、糖尿病等，对人们的健康生活构成极大的威胁。糖尿病作为21世纪公共卫生面临的挑战之一，主要被分为Ⅰ型以及Ⅱ型。深入研究糖尿病的发病机制，制定新的治疗方案及预防策略对糖尿病的防治具有重要意义。膳食模式对维持机体能量供给及稳态调节至关重要，膳食与肠道菌群、人体健康间存在着复杂的互作网络。近年来的研究发现，膳食模式是影响人体健康的重要因素[1-2]，其影响程度甚至强于遗传因素，不同膳食模式可能影响肠道菌群的结构和功能，进而影响人体健康[3-4]。又有研究表明，肠道菌群失衡是导致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素之一，不同膳食模式可影响肠道菌群的组成[5-6],而通过膳食模式干预糖尿病患者肠道菌群结构的研究较少，因此，本文通过研究轻断食对Ⅱ型糖尿病小鼠病程进展、肠道菌群结构组成的影响，为膳食模式干预糖尿病发展及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂16只体重(20±2)g的SPF级5周龄雄性C57BL/6J小鼠购于安徽医科大学实验动物中心，垫料由实验动物中心提供，高脂高糖饲料购于安徽医科大学实验动物中心，链脲佐菌素(STZ，V900890)购于Sigma 公司，柠檬酸(C8610)及柠檬酸钠(S8220)购于索莱宝公司。

1.2 仪器设备血糖仪购于三诺生物传感股份有限公司(YZB/湘0041-2014)，电子天平(FA2004)购于上海恒平仪器有限公司，无菌操作台(CJV1000-Y)购于山东新华医疗器械股份有限公司，小动物解剖台/外科实验解剖台(HMJP-2)购于大连华牧器材有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 构建T2DM小鼠模型 随机选取8只小鼠作为模型组，另8只小鼠作为对照组，模型组小鼠进行高脂饲料喂养28 d，对照组普通饲料喂养28 d。配制0.1 M(PH 4.5)的柠檬酸钠缓冲液：称取2.1 g柠檬酸溶于100 mL蒸馏水中(A液)，称取2.94 g柠檬酸钠溶于100 mL蒸馏水中(B液)，AB液1∶1混合后pH调为4.5。将链脲佐菌素(STZ)粉末溶于柠檬酸钠缓冲液配成5 mg/mL的STZ溶液，立即按1.0 mL/100 g将STZ溶液经腹腔注射模型组小鼠，等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射对照组。小鼠放回，给予普通饲料和10%蔗糖水，第二天换为正常饮用水。注射STZ 溶液14 d后，模型组小鼠禁食过夜后尾尖采血通过试纸检测血糖，血糖高于11.0 mmol/L即视为造模成功。

1.3.2 实验分组及处理 8只对照组小鼠中随机选取4只给与轻断食喂养作为轻断食对照组(标记为Cq组)，另4只进行正常喂养作为正常对照组(标记为Cz组)。8只T2DM模型鼠中随机选取4只给与轻断食喂养作为轻断食模型组(标记为Tq组)，另4只进行正常喂养作为正常模型组(标记为Tz组)。轻断食是隔天禁食(24 h)，禁食天与喂食天交替进行，于每d上午10：00更替，每d正常饮水。Cz、Cq、Tz和Tq四组小鼠喂养时间均为28 d。

1.3.3 样品采集测定 第0天和第28天分别测定四组小鼠的体重、血糖。血糖样本检测前小鼠需禁食不禁水过夜12 h，使用尾尖取血测定血糖数据。第28天测完血糖后对小鼠脱颈处理，无菌解剖后取结肠内容物，保存于1.5 mL EP管中，每管0.5 g，液氮冷冻后-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 测序鉴定 通过16SrDNA扩增子测序鉴定小鼠肠道菌群。采用干冰寄送样本，测序终浓度为20 pmol。高通量序列测定采用的测序平台是NovaSeq 6000，测序的区域为16SrDNA的V3-V4区，序列长度在250 bp左右，测序鉴定及肠道菌群结构分析工作均由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，包括菌群多样性分析、菌群构成分析、菌群结构差异性分析和LEfSe多级物种差异判别分析。菌群多样性分析包括Alpha多样性分析和Beta多样性分析，Alpha多样性分析中，Goods coverage指标反映测序深度，其值越接近于1说明测序深度越合理；Shannon值代表菌群多样性，Shannon值越大菌群多样性越丰富；Simpson值越大菌群多样性越低；Chao1值越大菌群数越多。Beta多样性采用主成分分析(PCA)。通过目水平及种水平上的物种相对丰度对菌群构成进行分析。通过属水平上物种相对丰度的聚类分析反映各组菌群结构差异性。线性判别分析(LDA)评估每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 进行差异分析，小鼠体重、血糖数据等以“均数±标准差”表示，两组间比较采用配对t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。高通量测序数据按97%相似性进行OUT聚类分析，注释OUT物种序列，进行菌群alpha多样性及beta多样性分析，绘制群落结构图，以及进行LEfSe 多级物种差异分析。

2 结果

2.1 轻断食对T2DM小鼠体重、空腹血糖的影响结果如表1所示，经过28 d喂养，Tz组小鼠体重增加27.14%(6.39±0.84)，Tq组小鼠体重增加17.20%(4.08±0.71)，与Tz组相比，Tq组小鼠体重增长速度显著减低，差异有统计学意义(P=0.0057)。Tz组小鼠空腹血糖降低3.31%(0.39±0.15)，Tq组小鼠空腹血糖降低10.73%(1.29±0.53)，与Tz组相比，Tq组小鼠血糖明显降低，差异有统计学意义(P=0.0172)。

2.2 肠道菌群结构

2.2.1 菌群多样性分析 Alpha多样性比较结果见表2，四组的测序深度饱和，Cq组菌群多样性最丰富，Tz组菌群多样性最差。所测四组样本中轻断食喂养组(Cq组和Tq组)菌群数分别多于正常喂养组(Cz组和Tz组)。

表1 轻断食对T2DM小鼠体重和空腹血糖的影响

表2 各组间Alpha多样性比较

Beta多样性结果见图1，轻断食喂养组(Cq组和Tq组)菌群结构均较正常喂养组(Cz组和Tz组)发生了偏移。Cz和Tz组在物种组成上有一定程度的相似，Tq与Tz组距离较远。

图1 各组样本菌群PCA分析

2.2.2 菌群构成分析 结果见图2，各组小鼠肠道菌群在目的水平上，拟杆菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridales)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、乳杆菌目(Lactobacillales)和疣状菌目(Verrucomicrobiales)为五种主要菌目。其中，拟杆菌目是4组中的优势菌目，在Tz组中相对丰度为81.90%。Cq组中梭菌目的相对丰度相比于Cz组提升了8.8倍(P=0.0003)，而Tq组中乳杆菌目的相对丰度相比于Tz组提升了3倍(P=0.0089)。

图2 目水平上的物种相对丰度

在菌种水平上，结果见图3，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)、柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)、产酸拟杆菌(Bacteroidesacidifaciens)和格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)为各组优势菌种。其中，罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌为Tq组的优势菌种，相对于Tz组分别提升了7.71%和3.52%；柔嫩梭菌为Cq组的优势菌种，相对于Cz组提升了4.40%；与Tz组相比，Tq组中艾克曼菌和产酸拟杆菌下降了7.07%和3.41%。

图3 种水平上的物种相对丰度(%)

2.2.3 菌群结构差异性 结果见图4，轻断食喂养(Cq组和Tq组)提升了厚壁菌门(Firmicutes)下多个种属的丰度。其中Tq组中，乳酸菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)等有益菌属相对其他组聚集较多，而肠杆菌门下的有害菌(臭气杆菌，Odoribacter)相对其他组含量降低。

图4 属水平的物种相对丰度聚类分析

2.2.4 LEfSe多级物种差异判别分析 由图5和图6可知，乳杆菌科(Lactobacillacea)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)是对Cq组群落结构影响较大的物种；厚壁菌门(Fimicutes)下的毛螺菌科(Lachnospiraceae)及瘤胃球菌科(Ruminoccaceae)是对Tq组群落结构影响较大的物种。

图5 各组样本LDA值分布柱状图

图6 各组样本的进化分枝图

3 讨论

糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，其中T2DM占95%。肠道菌群与T2DM的发生关系密切，可通过代谢、抗炎等改善糖尿病的进展。近年来关于T2DM肠道菌群改变的研究较多，马红梅等报道T2DM患者肠道厚壁菌门、拟杆菌属、柔嫩梭菌属和双歧杆菌属减少，并与胰岛β细胞功能指数呈负相关[7]。郎敏等研究发现肥胖II型糖尿病患者肠道厚壁菌门和变形菌门所占比例减少[8]。

本研究通过轻断食喂养后测定T2DM小鼠体重、血糖及肠道菌群的变化，探讨轻断食对改善II型糖尿病小鼠病程进展及肠道菌群结构的影响。结果显示轻断食喂养可以降低T2DM小鼠体重增长速度，同时具有降低糖尿病小鼠血糖的功效，这与栗晓华报道的轻断食可改善肥胖型II型糖尿病患者空腹血糖的结论具有一致性[9]。陈红洁等同样认为轻断食饮食模式对于肥胖人群具有显著的减重效果[10]，能够有效改善患者的血糖和血脂水平。

相比于正常进食，轻断食喂养对T2DM小鼠肠道菌群物种组成改变较大，小鼠肠道菌群多样性更丰富。在菌群组成上，轻断食喂养对健康小鼠肠道梭菌目和T2DM小鼠肠道乳杆菌目的调节作用明显。张永妍等发现妊娠糖尿病(GDM)孕妇的乳杆菌属和双歧杆菌属水平明显低于非GDM孕妇[11]。而我们研究发现T2DM小鼠轻断食喂养后乳杆菌目相对丰度相比于正常喂养的T2DM小鼠提升了3倍，优势菌种为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)和格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)。同时，LEfSe多级物种差异分析显示乳杆菌科(Lactobacillacea)也是轻断食对正常小鼠肠道菌群落结构影响较大的物种。蔡辉耀等报道T2DM患者血清miR-21-5p水平升高，与肠道乳杆菌含量成负相关[12]。许女等报道乳杆菌173可以显著上调肠道紧密连结蛋白及黏蛋白的表达，从而增强肠道黏膜屏障功能而降低血糖[13]。结合本研究内容，说明轻断食对调节T2DM小鼠肠道的乳杆菌有积极作用，同时与改善T2DM小鼠血糖水平相关。

我们研究发现毛螺菌科(Lachnospiraceae)及瘤胃球菌科(Ruminoccaceae)是对T2DM轻断食喂养小鼠肠道群落结构影响较大的物种。在任欣等报道中，小米饲料可通过增加糖尿病大鼠肠道乳酸杆菌和瘤胃球菌属的相对丰度，降低毛螺菌科细菌的相对丰度来降低血糖[14]。结合本研究内容，说明轻断食喂养可能通过调节瘤胃球菌科和毛螺菌科来改善T2DM小鼠的血糖水平。

综上所述，本研究通过构建T2DM小鼠模型，轻断食喂养后测定小鼠体重、血糖、肠道菌群等指标，确定了轻断食喂养对II型糖尿病小鼠病程进展和肠道菌群组成的影响。结果证实轻断食喂养能够改善糖尿病小鼠的体重和血糖，也能够提高肠道菌群的丰度，改善肠道菌群结构，增加有益菌群的数量，促进肠道菌群良性发展。本研究可为通过膳食模式改善糖尿病患者肠道菌群构成提供理论依据，为糖尿病的治疗提供新思路。