摘 要：该研究采用单因子指数法和尼梅罗综合污染指数法评价农田重金属污染程度，测定土壤相关酶活，并采用16s rDNA Illumina高通量测序技术，对铜陵市狮子山矿区周围受重金属污染农田细菌群落多样性进行了分析，以期了解铜陵狮子山矿区受重金属污染农田的细菌群落结构和优势菌种。结果表明，该地区农田土壤中铜、锌、砷、镉含量很高，属于重金属严重污染。农田土壤中过氧化氢酶、酸性磷酸酶和脲酶活性高，土壤酶活与重金属之间具有较好的相关性，不同元素的重金属对酶活的响应不同。高通量测序结果显示，属于Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria门的序列总和占全部序列的80.11%，是门水平上的优势菌种。在属水平上，Arthrobacter具有相对较高的丰度，为优势菌种。研究结果显示，铜陵矿区重金属严重污染情况下，土壤细菌仍具有较高的活性和多样性，为筛选具有重金属抗性的优势菌种提供依据。

关键词：土壤;重金属;酶;细菌

中图分类号 X53 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）11-0109-06

Analysis on Bacterial Community of Soil in Farmland Contaminated by Heavy Metals in Shizishan Mining Area

LI Yang

（Anhui Guozhen Environmental Restoration Co.， Ltd.， Hefei 230093， China）

Abstact： In this paper， single factor index and Niemelo comprehensive pollution index method were applied to evaluate the degree of heavy metal pollution in farmland， the soil enzyme activities were determine， 16S rDNA Illumina high-throughput sequencing was used to analyze the bacteria community diversity of heavy metal contaminated farmland， in order to understand the bacterial community structure and dominant species of heavy metal contaminated farmland in the Shizishan mining area in Tongling. The results showed that the content of copper， zinc， arsenic and cadmium in farmland soils in this area was very high， which was seriously polluted by heavy metals. The activities of catalase， acid phosphatase and urease in the soil were high， soil enzyme activity and heavy metals had a good correlation， different elements of heavy metals on the enzyme activity in response to different. The sequence of Proteobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria and Acidobacteria accounted for 80.11% of the total sequence， which were the dominant species at the door level. At the genus， Arthrobacter had a relatively high abundance and which was the dominant species. Although soil heavy metal pollution were serious， that soil bacteria still had high activity and diversity and could provide the basis for screening heavy metal resistance bacteria.

Key words： Soil; Heavy metal; Enzyme; Bacterial

1 引言

隨着工业发展，我国土壤重金属污染日趋严重，尤其是矿区附近土壤[1]。含有重金属的污染物进入土壤，不仅会降低土壤质量，也会危害人类健康[2]。土壤微生物数量大，种类繁多，在土壤生态系统稳定中扮演着十分重要的角色[3]。土壤微生物对重金属胁迫的响应要比同一环境中的动物和植物更加灵敏，在重金属胁迫下，土壤微生物从数量、活性、群落结构以及多样性等方面作出复杂的响应[4]。

狮子山矿区位于安徽省铜陵市东郊约7km，是长江中下游矿带最大的铜矿田，也是我国重要的铜资源生产基地之一。由于常年的矿山开发，造成严重的环境污染，Cd、Pb、Zn、Cu、As等是该地区主要的重金属污染元素，且污染正在逐渐加剧[5]。已有研究报道指出，矿区附近土壤由于长期受高浓度多重金属胁迫，土壤微生物作出复杂的响应。张雪晴等[6]指出随着矿区土壤重金属综合污染程度加大，土壤微生物多样性和酶活随之降低;郭建华等[7]试验结果表明，矿区附近受重金属污染的土壤微生物多样性并不简单地随污染程度加大而降低。目前，对于狮子山矿区土壤微生物群落结构多样性以及长期受重金属胁迫的农田土壤中优势菌种还缺少报道，因此明确该地区土壤中的优势细菌群落对于筛选重金属抗性菌种以及促进重金属污染生物修复等研究具有重要意义。

重金属通过诱导活性氧自由基产生，进而对微生物体造成产生不同程度的损伤，是重金属致毒的重要途径[8]。由于活性氧自由基的寿命短、检测困难，通过采用测定土壤酶活性来推测机体所受氧化胁迫程度[9]。矿区附近土壤微生物由于长期受高浓度重金属胁迫，谭林立等[10]研究发现，Cd、Pb对土壤脲酶活性均有一定抑制作用，对脱氢酶有显著抑制作用;王伟等[11]在研究汞污染对葡萄—土壤系统相关指标的影响时发现，在低Hg污染条件下，土壤碱性磷酸酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性均有一定增加，而土壤脲酶活性却显著下降;在高Hg污染下，4种土壤酶活性均出现下降趋势。罗虹、曹靖等研究发现，当土壤被Cu、Cd等多种重金属复合污染时，重金属会对土壤磷酸酶、脲酶等产生一定的激活作用[12-13]。由此可以看出，重金属污染对土壤酶的活性会造成影响，但二者并不是简单的线性关系，且不同的土壤酶活对不同金属的响应也有所不同。

目前，关于土壤微生物多样性已有多种成熟的研究方法，包括传统的分离纯培养和稀释平板计数、氯仿熏蒸法、Biolog微平板法、PCR-DGGE法、磷脂脂肪酸法（PLFA）以及新一代高通量测序和基因芯片技术[14-17]。杨元根等利用氯仿熏蒸法对城市和农村的土壤微生物量进行研究，发现重金属含量较高的城市土壤微生物量较农村土壤相对减少，但微生物呼吸强度和生理活动却显著高于重金属含量低的农村土壤[18];陈欣瑶等采用磷脂脂肪酸法对受重金属胁迫的土壤微生物进行分析，研究发现重金属胁迫对AM真菌的多样性和均匀性有明显抑制作用，减弱了其抵抗外界胁迫的能力[19]。以高通量技术为代表的新一代测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化等优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台，该方法也廣泛应用于重金属污染土壤微生物群落结构分析[1，20，21]。Marcin等用16s rDNA焦磷酸测序来分析重金属污染土壤中的细菌群落，发现Zn显著降低了土壤细菌多样性及其丰度[1];丁传雨[20]等用16s rRNA Illumina分析能源植物修复镉污染土壤过程中的细菌群落，发现Cd的添加对Gemmatimonas、Flavisolibacter等细菌的相对丰度有影响。铜陵狮子山矿区现有的研究主要是针对其土壤中重金属的特性和耐性植物以及生态退化的现状[22-23]。而对于该矿区农田土壤的优势菌种还缺少报道。基于此，本研究选用铜陵狮子山矿区周边农田土壤，评价重金属污染程度，分析土壤酶活性，并采用16s rDNA Illumina高通量测序技术，分析该地区农田土壤细菌群落结构及其优势菌种，为筛选具有重金属抗性的优势菌种提供依据。

2 材料与方法

2.1 土壤样品采集 土壤样品于2020年5月16日采集于安徽省铜陵市狮子山尾矿矿区附近一块较大农田，主要农作物为油菜。经纬度为N30°55′14.31"，E117°53′20.75″，每隔1km设1个采样区，共设3个取样区，每区10个采样点，利用内径5cm的PVC管，采集耕作层土壤（0～20cm），将每区采集土样混合成1个样品，分别编号为S1、S2和S3。将每个混合样品一分为二，一份立即用于土壤细菌分析，另一份自然风干后用于各项理化性质和土壤酶活的测定[24]。

2.2 理化性质测定 准确称取风干样0.5g（精确到0.0001g）于聚四氟乙烯消煮管中，采用HCl-HNO3-HF-HClO4四酸消解法于全自动石墨炉消解仪中进行消解，电感耦合等离子发射光谱仪ICP-AES测定土壤中Cu、Zn、As、Pb、Cd的含量。土壤碱性有效氮采用碱解扩散法[25];速效磷和速效钾分别采用Olsen法和1mol/L中性醋酸铵浸提火焰光度计法测定;土壤pH采用水土比为2.5∶1进行测定[26]。

2.3 土壤重金属污染评价方法 采用单因子指数法（Pi）和尼梅罗综合污染指数法（Pc）[24]。

2.3.1 单因子指数法 单因子指数计算公式为：

[Pi=Ci/Si] （1）

式中，Pi为土壤中金属i的环境质量指数;Ci为金属i的实际测量值（mg·kg-1）;Si为土壤中重金属i的评价标准值（mg·kg-1）（GB 15618─1995）。试供样品为农田土壤，执行土壤环境质量二级标准。该方法可以直观反映出各污染物的污染程度，而不能全面、综合地反映土壤污染程度[27]。

2.3.2 尼梅罗综合污染指数法 尼梅罗综合污染指数计算公式为：

[Pc=[（Ci/Si）2max+（Ci/Si）2ave]/2] （2）

式中，（Ci/Si）max为土壤污染指数的最大值;（Ci/Si）ave为土壤污染指数的平均值。综合污染指数法的土壤分类标准如下：0.7

2.4 土壤酶活性的测定 土壤酶活采用风干土样[28]，选用南京建成试剂盒测定土壤过氧化氢酶、酸性磷酸酶以及脲酶活性，使用紫外分光光度法，按试剂盒步骤进行操作，分别于240nm[29]、660nm、578nm[30]波长处测定其吸光度。

2.5 土壤总DNA的提取与纯化 土壤总DNA的提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO，USA）试剂盒，按照说书的提取步骤进行，将提取到的土壤总DNA使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测DNA纯度和浓度。

2.6 高通量测序 土壤DNA适当稀释后作为模板，进行PCR扩增。采用引物（515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对细菌16S rDNA的V4区进行扩增，片段长度约为300 bp，PCR反应体系为60µL，其中包含10x Ex Taq Buffer 6µL、dNTP 6µL、BSA 0.6µL、Ex Taq 0.3µL、Primer F 1.2µL、Primer R 1.2µL、DNA 1µL，补ddH2O至60µL。PCR扩增的反应条件为：预变性94℃、5min，94℃、30s，52℃、30s，72℃、45s，30个循环，最后72℃延伸10min，循环完成后利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。根据PCR产物的浓度，将各样品进行等浓度混样，利用Illumina Hiseq2500，PE·250测序平台对样品进行测序。本次高通量测序委托广州美格生物科技有限公司进行测序。

2.7 数据分析 高通量数据的生物信息学分析采用Qiime（Quantitative Insights into Microbial Ecology），对有效数据进行拼接及质控以获取扩增片段，对拼接结果进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类及物种注释以获得每个样品OTUs分布及物种信息[28]。基于以上信息对样品进行Alpha多样性分析，对物种的多样性及丰富度进行分析。每个样品所得微生物数据均为3次重复均一化后显示。重金属数据分析和相关图表制作在Excel 2010中进行，相关性分析在SPSS中进行。

3 结果与分析

3.1 土壤理化性质及重金属含量 土壤各项理化性质如表1所示，土壤样品重金属浓度及污染指数如表2所示。从表1可以看出，3个平行土壤样品均为酸性土壤。从表2可以看出，土壤樣品的综合污染指数均在3以上，属于严重污染。其中，Cu、Cd、As3种元素的单因子污染指均在5左右，属于严重污染;Zn的浓度是土壤环境质量二级标准的0.8～1.8倍;土壤Pb浓度最低，未超过标准。

3.2 土壤酶活及与重金属污染之间的相关性 土壤过氧化氢酶（S-CAT）、酸性磷酸酶（S-ACP）和脲酶（S-UE）的活性如表3所示。其中脲酶活性最高，酸性磷酸酶次之，过氧化氢酶活性相对较低。从表4可以看出，土壤脲酶与Cu、Cd呈显著正相关（P<0.05），与As、Pb呈显著负相关（P<0.05），与Zn未达到显著水平。酸性磷酸酶与Cu呈极显著负相关（P<0.01），与Zn、As呈显著正相关（P<0.05），Cd呈极显著正相关（P<0.01），与Pb未达到显著水平。过氧化氢酶与Zn、Pb呈显著负相关（P<0.05），与Cd呈显著正相关（P<0.05），与As未达到显著水平。由上可见，同一种土壤酶活对于不同种重金属元素，同一种元素对于不同酶活之间均会表现出不同的响应。其中，Cd对于3种酶活性均产生一定的刺激作用，除Cu以外的4种元素均对酸性磷酸酶活性产生一定的刺激作用。

3.3 高通量测序结果 高通量测序结果表明，实验样品的文库覆盖率在99%以上，可较全面地反映土壤细菌的种类和结构。实验样品的平均序列条数为161941，OTUs平均数为4220。由图1可知，3个样品稀释曲线趋于平坦，说明本研究中3个样品测序数据量合理。经分析发现，3个土壤样品中细菌有9个门，包括Proteobacteria（变形菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）、Planctomycetes（浮霉菌门）、Nitrospirae（硝化螺旋菌门）（图2）。其中，Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria 4个门的序列总和占全部序列的80.11%。为了进一步揭示土壤样品中微生物的组成结构，分析了样品在属水平上相对丰度大于0.1%的物种相对丰度（图3）。由图3可知，相对丰度大于0.1%的物种仅有13种，其中包括Arthrobacter（节杆菌属）、Anaerolinea（厌氧绳菌属）、Bradyrhizobium（短根瘤菌属）、Streptomyces（链霉菌属）、Rhodoplanes（红游动菌属）以及Rubrivivax（红长命菌属）等。在属水平上，物种的丰度都相对较低，但Arthrobacter表现出了相对较高的丰度，占全部序列的4.19%。

4 讨论

根据单因子指数法，该地区土壤中Cu、Zn、As、Cd元素超出了国家二级标准几倍，属于重金属污染;根据尼梅罗综合指数评价法，该地区属于重金属严重污染，这与现有对该地区重金属污染研究结果显示一致[31-32]。污染的主要原因为矿区长年开采，以及在开发和冶炼金属过程中产生的尾矿、矿渣和酸性废水。该地区土壤长期受重金属污染，土壤微生物的活性因此受到了一定程度的抑制或激活。土壤微生物活性与土壤酶活密切相关。重金属的浓度效应是决定对土壤酶活的关键，且单一重金属和重金属复合污染对酶活会表现出不同的响应[33]。有研究指出，在单一Pb污染下，土壤酸性磷酸酶活性随着Pb浓度增加而降低，而土壤脲酶呈相反变化。单一Cd污染下，2种酶活效应与Pb呈相反趋势。Pb、Cd复合污染条件下，脲酶和酸性磷酸酶活性均随重金属浓度增加而减小[34]。重金属对过氧化氢酶的影响报道不一致，如Belyaeva等的研究表明过氧化氢酶活性受重金属的影响较小，而Khan等的研究报道则为过氧化氢酶活性在Cd、Pb的浓度成正比。本研究中，供试土壤中Pb浓度低而Cd浓度高，与上述研究中Pb、Cd单一污染条件下酶活呈相反的趋势，这可能是多种重金属复合污染共同作用所体现的结果，也可能是由于该地区长期耕作使植物的根际微生物发生了改变[35-38]。同时土壤是一个复杂的环境，因此非生物等外界条件也会在一定程度上影响土壤酶活和微生物[39]。

目前，对于该矿区的细菌多样性以及优势菌群的研究还鲜见报道，对该地区已有的研究主要集中在土壤中重金属特性以及生态退化的现状[5，32]。本研究结果表明，在该地区长期受重金属胁迫的土壤中，微生物多样性相对不高，但优势菌群相对较多，可能是这些菌种在重金属长期胁迫下产生了抗性[40]。张汉波等[41]研究发现，Arthrobacterjie（节杆菌属）对Pb、Zn、Cd都具有抗性，其中对Pb的抗性最强;肖炜等[42]发现Proteobacteria（变形菌门）对Pb、Cd表现出了很强的耐受性;谢学辉[43]在研究中指出Chloroflexi（绿弯菌门）对Cu、Zn具有一定的抗性;冯淏[44]通过实验研究发现Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）对铬具有非常强的耐受性，在修复铬污染方面具有非常大的潜力。本研究发现Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria等4个门以及Arthrobacterjie节杆菌属属于该地区优势菌种，这些菌种在各种研究文献记载中发现对一种或多种重金属具有耐受性。这些微生物可能具有某些特殊功能，能够耐受重金属胁迫。另外，该地区的土壤表现为酸性，可能与土壤中重金属共同作用使微生物产生了抗性[45]。因此，本研究对于筛选重金属抗性菌株具有一定的意义，为筛选重金属抗性菌株提供了一定的依据[46-47]。但是，这些菌种对重金属的抗性机制还有待进一步研究[48-49]。

5 结论

采用单因子指数法和尼梅罗综合指数法评价铜陵狮子山矿区受重金属污染的农田，该研究区域农田污染的重金属元素为Cu、Zn、As、Cd，属于重金属严重污染。由于农田长期耕作，该研究区域过氧化氢酶、酸性磷酸酶和脲酶活性高。高通量测序结果表明在细菌门水平上，该研究区域优势菌种为变形菌门Protebacteria、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria和放线菌门Actinobacteria;在属水平上Arthrobacter为优势菌种。

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作者简介：李阳（1990—），男，安徽合肥人，工程师，研究方向：土壤修复。  收稿日期：2022-02-05