刘辰 邹庆宝 赵济全

[摘要]目的探究Exendin-4对hIAPP转基因鼠的保护作用及其可能的作用机制。方法正常小鼠和hIAPP转基因鼠分别注射PBS和Exdendin-4，共分為四组：正常小鼠对照组（WT+PBS）、正常小鼠注射Exendin-4组（WT+Ex-4）、hIAPP小鼠对照组（homo+PBS）、hIAPP小鼠注射Exendin-4组（homo+Ex-4），每组6只。对四组小鼠进行2个月每天一次的腹腔注射，给药结束后进行葡萄糖耐受实验;体外培养Min6胰岛β细胞，取对数生长期细胞分别加入2.5、5、10、20μM的hIAPP完全培养基，检测细胞周期相关蛋白的表达;分离小鼠原代胰岛细胞，AnnexinV-FITC检测细胞凋亡;提取小鼠胰腺组织蛋白，检测周期相关蛋白表达水平变化。结果homo+PBS组小鼠葡萄糖耐受能力显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），hIAPP体外处理Min6细胞会剂量依赖式下调ABC蛋白及周期相关蛋白CCND2和CCND3的蛋白表达。相反，homo+Ex-4组的小鼠葡萄糖耐受能力显著增强，差异有统计学意义（P<0.05），原代胰岛细胞的凋亡比例明显降低，细胞周期蛋白CCND2和CCND3的表达水平增加。结论Exendin-4对hIAPP转基因鼠造成的胰岛损伤具有保护作用，其机制与调控胰岛细胞增殖和凋亡有关。

[关键词]Exendin-4;胰岛淀粉样多肽;细胞增殖;细胞凋亡

[中图分类号]R587.1

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2022）11-0027-04

2型糖尿病胰岛β细胞病变的主要特点是β细胞质量和功能减退而不能分泌足够的胰岛素[1]。胰岛淀粉样蛋白沉积是导致胰岛β细胞功能逐渐丧失的重要因素[2]。淀粉样蛋白的独特成分是胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP），人源胰岛淀粉样多肽（human IAPP，hIAPP）是由胰岛β细胞合成的具有37个氨基酸的短肽。hIAPP的过度沉积会导致胰岛β细胞的凋亡并损伤葡萄糖代谢，从而导致2型糖尿病的发生[3]。Exendin-4含有39个氨基酸残基，属于GLP-1受体长效激动剂。研究发现Exendin-4可以通过多种途径改善胰岛β细胞的功能，起到治疗糖尿病的作用[4]。然而，这种作用是否发生在由内源性hIAPP形成的淀粉样蛋白沉积的条件下尚不清楚，本研究旨在探讨Exendin-4在体内对hIAPP转基因鼠的保护作用及其可能的分子机制。

1材料与方法

1.1材料

hIAPP转基因小鼠购自JacksonLab;血糖仪和血糖试纸购自三诺生物传感公司;hIAPP购自肽谷生物科技有限公司;Exendin-4购自MCE公司;小鼠Min6胰岛β细胞由本实验室保存;胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司;AnnexinV-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司;ABC和β-catenin抗体购自CST公司;CCND2、CCDN3和CDK4购自ABclonal公司;β-Actin抗体购自Proteintech公司;PVDF膜、ECL发光液购自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1小鼠Exendin-4处理将6～8周龄雄性小鼠分为四组：正常小鼠对照组（WT+PBS）、正常小鼠注射Exendin-4组（WT+Ex-4）、hIAPP转基因小鼠对照组（homo+PBS）、hIAPP转基因小鼠注射Exendin-4组（homo+Ex-4）。Exendin-4按照10nmol/kg的剂量给药。对四组小鼠进行2个月每天一次的腹腔注射，给药结束后进行葡萄糖耐受实验（oral glucose tolerancetest，OGTT）。

1.2.2小鼠葡萄糖耐受实验实验前先将小鼠禁食16h，而后检测小鼠血糖水平作为起始血糖值，然后，对小鼠按照2g/kg体重的标准进行葡萄糖腹腔注射，分别在30、60、120min尾静脉取血测定血糖水平。

1.2.3小鼠胰腺组织取材每组取3只小鼠用3%的戊巴比妥钠麻醉后，打开胸腔，将灌流针刺入心尖，先用生理盐水进行冲洗，然后灌注4%的多聚甲醛，当肝脏发白时灌流结束。迅速摘取胰腺组织于-80°C保存，用于蛋白检测。

1.2.4小鼠原代胰岛细胞分离每组取3只小鼠颈椎脱臼处死后用酒精浸泡消毒。在生物安全柜中打开腹腔，十二指肠的开口处灌注Hank’s盐，当胰腺膨胀后，摘除胰腺组织装入盛有预冷Hank’s盐的平皿中，剪成1～3mm的小块，在37°C培养箱中消化15min后加入预冷Hank’s盐中止消化，1500r/min室温离心3min洗涤3次，用PBS重悬后置于冰上用于后续流式细胞仪检测。

1.2.5Annexin V-FITC检测细胞凋亡将分离好的小鼠胰岛细胞加入5μl Annexin-V-FITC和10μl碘化丙啶（PI）试剂，室温避光孵育20min，随后立即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶（PI）为红色荧光。

1.2.6Westernblot检测相关蛋白表达RIPA裂解液裂解细胞，BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离，半干法转运至PVDF膜，室温封闭1h，加入一抗抗体4°C孵育过夜。TBST洗涤后，二抗室温孵育1h，加入ECL发光液，使用天能成像系统进行检测。

1.3统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Exendin-4提高hIAPP小鼠的葡萄糖耐受能力

腹腔注射葡萄糖后，各组小鼠的血糖水平均升高。相比WT+PBS组，homo+PBS组上升更为显著，差异有统计学意义（P<0.05），而homo+Ex-4组血糖水平相比homo+PBS组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），随着时间的增加，WT+PBS组的血糖几乎恢复到正常水平，而homo+PBS组仍较高，homo+Ex-4组血糖水平迅速下降。见表1。

2.2hIAPP抑制胰島β细胞周期相关蛋白的表达

不同浓度的hIAPP体外刺激小鼠Min6胰岛β细胞48h。Western blot结果显示，hIAPP可以明显抑制ABC、CCND2以及CCND3的蛋白表达，并且呈现剂量依赖，而CDK4和β-catenin的蛋白表达水平无明显变化，见图1。

2.3Exendin-4抑制hIAPP转基因小鼠的胰岛细胞凋亡

小鼠原代胰岛细胞凋亡分析结果显示，相比于WT+PBS组（1.43%），homo+PBS组的早期凋亡细胞数明显增加（21.3%），而homo+Ex-4组可以明显降低由hIAPP导致的原代胰岛细胞凋亡比例（9.76%），WT+Ex-4组无明显变化，见图2。

2.4Exendin-4促进hIAPP转基因小鼠的胰岛细胞周期相关蛋白表达

小鼠原代胰腺细胞Western blot结果显示，homo+PBS小鼠原代胰岛细胞中CCND2和CCND3的蛋白表达显著降低，而Exendin-4可以逆转由hIAPP导致的CCND2和CCND3的降低，见图3。

3讨论

2型糖尿病的主要特征是胰岛β细胞的功能下降所引起的慢性高血糖，通常伴有胰岛素敏感性降低[5-6]。尽管β细胞的功能改变在糖尿病的发病中起到关键作用，但β细胞数量的减少同样对糖尿病的病理进展具有重要影响[7]。与非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者体内β细胞数量减少了40%～65%[8]。目前认为增殖能力降低且凋亡增多是造成β细胞数量减少的主要因素。在2型糖尿病患者的胰岛组织中发现有大量的淀粉样蛋白沉积，经鉴定发现其主要成分是IAPP[9]。胰岛周围高浓度的IAPP通过形成大量淀粉样沉积导致β细胞的功能紊乱[2]。在动物模型中，过表达hIAPP能够显著增加淀粉样蛋白沉积，导致β细胞功能障碍和凋亡[10-11]。本研究发现，hIAPP转基因小鼠的葡萄糖耐受能力明显减弱，表现出了糖尿病症状。

Exendin-4是一种葡萄糖浓度依赖性促胰岛素分泌剂，可通过促进胰岛β细胞的增殖、调控细胞自噬以及抑制细胞凋亡来改善胰岛的功能[4，12]。但是Exendin-4是否在体内对hIAPP转基因鼠具有保护作用尚缺乏研究。在本研究中，体内注射Exendin-4可以明显增强hIAPP转基因小鼠的葡萄糖耐受能力，提示Exendin-4具有改善IAPP诱导的细胞凋亡作用。

细胞周期是在众多蛋白分子调控下最终产生两个新的子细胞的过程[13]，细胞周期蛋白（cyclin）通过与细胞周期依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）相互协作，共同维持和协调细胞周期的运行[14-15]，细胞周期的正常运转对于维持细胞数量和功能至关重要[16]。在本研究中，hIAPP在体外会明显抑制小鼠β细胞中细胞周期相关蛋白CCND2和CCND3的表达，而对细胞周期依赖性激酶CCRK和CDK4无影响。在hIAPP转基因小鼠原代胰岛细胞检测中发现，体内注射Exendin-4可以有效逆转由hIAPP导致的周期蛋白CCND2和CCND3的表达丢失，提示Exendin-4可以促进体内胰岛细胞增殖。另外，本研究还发现，hIAPP转基因小鼠的胰岛组织中凋亡细胞比例明显增加，而Exendin-4处理组细胞凋亡比例显著降低，说明Exendin-4具有抑制胰岛细胞凋亡的功能。

综上所述，Exendin-4可以恢复hIAPP转基因小鼠的胰岛功能，其作用机制可能与Exendin-4促进小鼠体内胰岛细胞增殖并且抑制胰岛细胞凋亡有关。本研究为Exendin-4的临床应用提供了新的理论指导。

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（收稿日期：2021-12-23）