辛丽欣，张 欣，殷 博，甄 涛

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，在自然环境中广泛存在。该菌株是常见的植物内生细菌，主要分布在植物的根和茎部，具有分布范围广[1-2]、分离纯化简单、抗菌活性和抗逆好等特点，目前广泛应用在黄瓜、玉米等主要经济农作物上[3-4]，具有较好的生物防治效果。通过响应面法获得枯草芽孢杆菌SW01的最佳培养基配方[5]，显著提高了芽孢数量，为生防菌剂的大面积推广奠定了科学理论基础[6-7]。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

菌种：枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)SW01由本验室分离保存。

培养基：葡萄糖1%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%、琼脂2%，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

试剂：葡萄糖、玉米粉、豆饼粉、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰，硫酸铵、碳酸钙等试剂均为分析纯，购自天津化工。

1.2 方法

菌株活化：将-80℃保存的SW01菌株接种到平板培养基中，30℃倒置培养24 h。

筛选显著因子：采用Plackett-Burman方法筛选显著因子，对培养基的组分进行单因素水平试验，对影响因子选取高低两个水平。

响应面法优化培养基配方：利用Design8.0简体软件，通过Plackett-Burman设计法，筛选培养基中影响芽孢数量的显著因子，结合响应面分析法，确定最佳培养基配方，通过模型验证实验结果。

2 结果与分析

2.1 培养基配方优化

通过Plackett-Burman法设计初始发酵培养基组分中的9个影响因子[8]，分别为玉米粉、CaCO3、(NH4)2SO4、葡萄糖、K2HPO4、酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、豆饼粉，每个因素取高低两个水平，结果见表1～表3。从实验结果和方差分析获得排序，显著顺序为玉米粉>豆饼粉>葡萄糖>酵母粉>K2HPO4>MgSO4·7H2O>MnSO4>CaCO3>(NH4)2SO4，(NH4)2SO4影响最不显著。

表1 影响因子与水平Tab.1 Influencing factors and levels

表2 Plackett-Burman实验结果Tab.2 Test results of Plackett-Burman

表3 方差分析结果Tab.3 ANOVA results

2.2 显著因子的最佳浓度确定

确定3个显著因子分别为玉米粉、葡萄糖、豆饼粉，其他条件均为K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O0.2%、MnSO40.02%、CaCO30.1%，从而获得最佳响应值。由表4可见，经实验数据分析获得二次多项式方程：

表4 芽孢数方差分析表Tab.4 Variance analysis table of the number of spores

Y=6.066 7-0.162 5A+0.112 5B+0.15C-1.545 8A2-0.295 8B2-1.170 8C2-0.275 0AB+0.15AC+0.15BC

从响应面图1～图3中可确定芽孢数为6.091 58×109cfu/mL；优化的原料配比为A=-0.070 7，B=0.232 3，C=0.070 7，即为玉米粉2%，葡萄糖为0.6%，豆饼粉为3%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O0.2%，MnSO40.02%，CaCO30.1%。

图1 玉米粉与葡萄糖交互作用对芽孢数的影响Fig.1 Effect of interaction between corn meal and glucose on the number of spores

图2 玉米粉与豆饼粉交互作用对芽孢数的影响Fig.2 Effect of interaction between corn flour and soybean meal on the number of spores

图3 葡萄糖与豆饼粉交互作用对芽孢数的影响Fig.3 Effect of the interaction of glucose and soybean meal on the number of spores

2.3 模型实验验证结果

为验证结果有效性，以极值点玉米粉2%、葡萄糖为0.6%、豆饼粉为3%、K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、MnSO40.02%、CaCO30.1%，最大芽孢数为6.091 58×109cfu/mL，按照上述配比验证结果为6.125 4±0.28×109cfu/mL，结果与预测值相近，该模型拟合度较好。

3 讨论与结论

在菌剂生产中所需的培养基通常选择材料价格低廉、来源广泛的，因此本实验中选择玉米粉、豆饼粉等为培养基，降低生产成本。在枯草芽孢杆菌发酵过程中，通过改良单一因素或正交实验确定交互作用，无法准确地确定显著因子及最佳条件。通过Plackett-Bruman实验方法，筛选出影响SW01的显著因子为玉米粉、葡萄糖和豆饼粉，采用响应面分析确定各显著因素的最佳数值[9]，获得SW01最佳培养基配方为：玉米粉2%、葡萄糖为0.6%、豆饼粉3%、K2HPO40.2%、MgSO4·7H2O0.2%、MnSO40.02%、CaCO30.1%，最大芽孢数为6.09×109cfu/mL。