高文欣, 李希琳, 傅煜轩

(苏州大学生物医学研究院, 江苏 苏州, 215000)

作为一种新发传染病病原体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)全球大流行在世界范围内造成了巨大的健康危机和无以估量的损失，故亟需针对病毒的致病机制进行详细阐述和研究[1]。SARS-CoV-2为正股单链RNA病毒，基因组长约30 kb, 包含多达8个非结构基因(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b和ORF9)[2-3]。ORF3作为冠状病毒特有的重要非结构基因，可编码翻译2种辅助蛋白，即ORF3a和ORF3b。相关研究[4]表明，冠状病毒辅助蛋白ORF3a、ORF3b广泛参与宿主免疫调控，在病毒的致病性中发挥着重要作用，且能够反映病毒毒力，还是病毒RNA复制、组装以及释放所必需的。不同冠状病毒ORF3a、ORF3b基因序列保守性较差，易突变或缺失[5]。目前, SARS-CoV-2辅助蛋白ORF3a、ORF3b的功能尚不明确，本研究探讨了特异性辅助蛋白ORF3a、ORF3b对SARS-CoV-2致病性的影响，以期为深入理解其致病机制并提出针对性防控策略奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人肺细胞系A549细胞和人肾上皮细胞系293T细胞购自美国ATCC细胞库; ploy(I∶C)购自美国Sigma公司; RIPA裂解液、Lipofectamine 3000、SYBR Green Master Mix试剂均购自美国Life Technologies公司; 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司; 多聚甲醛、TritonX-100化学试剂购自南京化学试剂股份有限公司; MyD88、TRAF6和GAPDH一抗均购自美国CST公司; pFLAG-NC、pFLAG-ORF3a、pFLAG-ORF3b表达载体和S、M、E及N表达载体购自美国Addgene公司; PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒购自大连TaKaRa公司; ABI-7500实时定量聚合酶链式反应仪(美国Applied Biosystems公司); Olympus FluoView FV10i荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 总RNA提取及炎症因子检测

将A549细胞铺板，密度为60%～80%, 对A549细胞予以ploy(I∶C)刺激并通过Lipofectamine 3000转染ORF3a或ORF3b表达载体，设置2组分别转染ORF3a表达载体(pFLAG-ORF3a组)、ORF3b表达载体(pFLAG-ORF3b组)，并设置未处理组(Mock组)和单纯ploy(I∶C)刺激组(control组)。……