邱丹丹 综述 蒋 松 审校

RNA测序技术是全转录组范围内分析基因差异表达和mRNA差异剪切的重要工具[1]。早期的RNA测序技术主要应用于组织样本或细胞群,称为组织/细胞群RNA测序(bulk RNA-seq),测量一个大的组织或细胞群体中每个基因的平均表达水平,对比较转录组学是有帮助的。但细胞间基因表达异质性被平均值掩盖,因此bulk RNA-seq对于研究复杂的异质性系统,例如脑、肾脏等器官的不同细胞功能是不足的。近10年应运而生的单细胞RNA测序技术(scRNA-seq),可从单细胞层面描绘RNA表达谱,识别异质细胞群中的数量少但发挥特殊功能的细胞亚群,成为发现与生理和疾病表型相关的细胞亚群,并鉴定其功能的强大工具[2-3]。然而,scRNA-seq技术最重要的局限性是,在单细胞制备过程中会丢失细胞在局部组织中的空间位置信息,而后者是揭示不同类型细胞间相互作用和信号转导的重要依据,也是帮助确定生理和病理状态下组织内环境变化的关键因素。因此,空间转录组学就是在获得不同类型细胞基因表达数据的同时,标注其在组织局部的空间位置。本文将介绍常见的空间转录组技术,并综述其在肾脏疾病研究中的应用。

空间转录组技术

空间转录组技术是将空间维度和组织形态整合到组织细胞的全基因组转录图谱中,以便在完整组织背景下探索不同细胞参与的病理生理过程。近年来,空间转录组技术迅猛发展,不同技术方法可识别的转录本数量、可操作性和经济成本各不相同。纵观空间转录组技术的发展过程,大致可分为以下三类。

基于原位杂交的空间转录组技术最早利用原位杂交方法可视化识别RNA空间位置的技术称为单分子荧光原位杂交技术(smFISH)[4]。该技术使用一个或多个标记有荧光团的短寡核苷酸探针靶向结合RNA,实现RNA荧光原位杂交。该方法一个探针只能识别一种转录本,仅可同时识别3～4个RNA。2002年,Levsky等[5]发明了使用n种荧光探针组合标记一个转录本的方法,使理论可识别的转录本种类扩大为n的排列组合数2n-1个。2011年,Advanced Cell Diagnostics公司推出了商业化RNAscope分析试剂盒,采用独特的双Z探针设计和自身级联放大反应,可高效敏感地检测到目标RNA,可同时检测12个RNA。2014年,Lubeck等[6]发明了顺序FISH方法(seqFISH),每次杂交使用标记有F种荧光团的探针,行n次杂交,理论上可识别Fn个转录本。然而,组合标记和顺序杂交在增加转录本识别数的同时也显著增加检测误差,在实际应用中这两种方法可同时检测的转录本种类10～30个[7]。2015年,Chen等[7]发明了多路复用容错纠错FISH技术(MERFISH),首先将每一种转录本用n位二进制进行编码,使用组合标记和n轮顺序杂交的方法,在每一轮杂交成像时,只有应该读为1的RNA子集会发出信号,最终通过读出的二进制条码识别转录本。该方法还可通过调整编码方案进行检错和纠错,提高检出率的同时降低误读率。至2019年,MERFISH方法在单细胞中可识别的转录本数已增加到10 000种[8]。

基于原位测序的空间转录组技术2013年,Ke等[9]利用挂锁探针和滚环扩增方式实现固定组织或细胞的RNA原位测序(ISS),该方法仍然是靶向检测,受序列读取长度和扩增产物大小的限制,可识别的转录本有限(约100个)。2015年,Lee等[10]发明了荧光原位测序技术(FISSEQ),将原位逆转的cDNA环化,再进行滚环扩增,然后在四色成像显微镜上通过荧光标签进行手动测序。FISSEQ可非靶向的检测基因组数据,理论上可获得全转录组数据,但受核糖体RNA高表达的影响,低测序深度限制了可识别的mRNA数量,每个细胞可检测出约200种高丰度mRNA分子,而低丰度的mRNA则难以被检测出来。

基于空间条形码的空间转录组技术原位杂交和原位测序技术均可在单细胞层面直观展示转录本的空间位置,但实验过程复杂,对技术和仪器要求较高,尚不能无偏倚地反映全转录组数据。而靶向探针的使用限制了发现新基因和突变基因的可能。此外,受组织自发荧光的影响,在组织中的应用效果欠佳。简单易行且高通量的空间转录组技术是今后发展趋势。空间条形码技术可在组织中标记空间位置,并可与二代测序技术兼容,是当前广泛使用的真正的组织空间转录组技术。

2016年,Ståhl等[11]首次实现在组织切片中原位捕获mRNA,并开创性在寡核苷酸序列中引入条形码序列以标记组织空间位置,实现在组织切片中完成空间转录组测序,并将该技术命名为空间转录组技术(ST)(原理示意图见图1)。该方法使用的载玻片捕获区域为6.2×6.6 mm2,阵列排序直径为100 μm,中心距为200 μm的捕获点,每个捕获点中含有约2亿个捕获探针,捕获探针包含空间条形码序列、唯一分子标识符(UMI,用于mRNA定量)以及寡聚脱氧胸苷酸(oligo-dT),捕获组织透化后垂直释放的mRNA,随后进行cDNA合成、文库构建和测序工作,最后利用空间条形码将RNA-seq数据与组织图像对齐,从而实现可视化分析。2019年,10x Genomics 公司在此技术基础上推出了商业化Visium空间转录组技术。Visium技术使用的每张载玻片有4个6.5×6.5 mm2捕获区域,每个捕获区域中阵列排序的捕获点直径缩小为55 μm,中心距缩小为100 μm,进一步提高了空间分辨率。Visium技术简单易行,适用于冰冻组织和石蜡包埋组织,使普通实验室也可进行空间转录组学研究。但是每个捕获点间存在信息丢失,可能会导致少数稀有细胞亚型关键基因表达信息的缺失。

图1 空间转录组技术原理示意图[1]

2019年,Rodriques等[12]及Vickovic等[13]分别发明了切片测序(Slide-seq)以及高分辨空间转录组技术(HDST)。这两种技术均沿用了带有空间条形码的捕获探针技术,不同的是将ST/Visium载玻片上凹槽样的捕获点调整为带有捕获探针的磁珠。Slide-seq使用的磁珠直径是10 μm,而HDST使用的是2 μm,使空间分辨率缩至2～10 μm,但仍无法达到单细胞水平。2021年,Cho等[14]建立了Seq-Scope方法,利用两轮测序步骤,第1轮测序生成组织切片mRNA空间坐标信息,第2轮测序获取捕获的cDNA以及空间条形码信息,构建空间基因表达矩阵。该方法可使空间分辨率进一步缩至0.5～0.8 μm,可进行单细胞和亚细胞级的空间转录组学研究。然而目前Slide-seq、HDST以及Seq-Scope等技术尚未实现商业化。

空间转录组和其他组学数据的整合应用

近年来,空间转录组技术快速发展,这一发展使在组织中同时进行高分辨率、无偏倚的空间多组学研究成为可能,但其在不同疾病研究中的应用有待进一步探索。

空间转录组技术联合scRNA-seq可同时在时间和空间维度上提供单个细胞水平的基因表达和细胞种类信息。2014年,Durruthy-Durruthy等[15]首先利用scRNA-seq获取数百个听囊细胞的基因表达谱,随后参考已有的通过原位杂交技术获得的听囊组织空间表达图谱,构建听囊组织空间三维模型,根据scRNA-seq结果运用算法重构基因表达在组织中的空间位置。这种方法可巧妙地为单细胞测序数据添加空间位置信息,推动了利用scRNA-seq数据重构组织空间表达图谱的发展。该方法还成功应用于斑马鱼胚胎组织[16]、海洋环节动物大脑组织[17]等。值得注意的是,目前大部分组织尚无可用的组织空间参考图谱。2019年,Nitzan等[18]发明了novoSpaRc计算框架,该框架假设“相邻细胞之间的基因表达图谱通常比相隔距离较大细胞更相似”,在没有空间参考的情况下,利用scRNA-seq数据对单细胞基因表达进行空间重构。

随着条形码技术的成熟,基于空间条形码的空间转录组技术与scRNA-seq的整合应用逐渐增多。2019年,Asp等[19]利用ST空间转录组技术、scRNA-seq技术以及原位测序技术,构建了人类胚胎心脏全面的时空基因表达图谱,这对于研究心脏功能和心肌细胞发育机制具有特殊价值。2020年,Moncada等[20]同时利用ST和scRNA-seq技术对人胰腺导管腺癌组织进行测序,最终绘制了在胰腺肿瘤微环境中不同细胞类型和亚群的位置以及肿瘤亚区内不同细胞类型之间的关系。2021年,Fawkner-Corbett等[21]结合Visium空间转录组和scRNA-seq技术绘制了人类肠道发育的单细胞时空图谱。ST空间转录组技术可高通量获取空间特异性信息,与scRNA-seq技术的整合应用为构建组织/器官的3D模型以及探寻肿瘤等疾病的治疗靶点和预后标志物提供了重要手段。

近年来,研究人员还不断探索从空间维度整合转录组和蛋白组数据。2018年,Schulz等[22]扩展了成像质谱流式(IMC)的方法,联合RNAscope金属原位杂交技术,在组织切片中同时检测了3种mRNA和16种蛋白,这种方法使在组织切片中同时检测多种mRNA和蛋白质成为可能。2019年, NanoString公司开发了名为数字空间分析(DSP)的空间组学平台。DSP技术通过可紫外线光裂解接头将寡核苷酸标签添加到蛋白或RNA探针上,利用自动化数字微镜装置对选定的兴趣区(ROIs)进行紫外线光裂解,释放的寡核苷酸标签通过nCounter系统或二代测序技术进行定量。该技术可通过使用连续的组织切片同时获得空间转录组学和蛋白组学数据,理论上可检测的蛋白质最多可达96种,结合二代测序技术可检测的RNA则不限数量[23-24]。2020年,Liu等[25]开发了基于微流体条码标记的空间组学测序技术(DBiT-seq),通过二代测序技术在甲醛固定的组织中共定位mRNA和蛋白质。该技术在同一张组织切片中使用平行微流控通道,先后将可识别mRNA(A1～50)和蛋白质(B1～50)的含有空间位置信息的DNA条形码传递到甲醛固定的组织载玻片表面,最终产生组织像素的二维拼接,每一个拼接点通过AiBj(i=1～50, j=1～50)进行空间定位。该方法可在组织背景下绘制高分辨率、多组学空间图谱,有望成为绘制组织内包括蛋白质、转录组和表观基因组等共定位的常用技术。

综上所述,将空间转录组技术与其他组学相结合,不仅可获得组织内更完整的生物学多维图谱,而且利用这些整合了空间信息和多维组学信息的方法,可以从组织特定部位的特定细胞层面上探寻新的发病机制、发现新型细胞和分子标志物,开发新的治疗靶点。

空间转录组学技术在肾脏疾病领域中的应用

空间转录组可以提供组织结构和细胞相互作用等信息,但目前该技术主要应用于发育生物学[19,21,25]、肿瘤[20,22]、神经病学[12,26]等领域,在肾脏领域的应用仍处于早期阶段。

2021年1月,Kuppe等[27]利用scRNA-seq和RNAScope空间转录组技术绘制了人类和小鼠肾脏纤维化细胞图谱。首先对13例高血压肾病患者肾小管间质的33 690个近端小管上皮细胞和53 670个非近端小管上皮细胞行单细胞转录组测序,发现在肾纤维化过程中表达细胞外基质相关基因的细胞主要为周细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞。随后利用RNAScope技术鉴定了肌成纤维细胞主要来自Notch3+/RGS5+/Pdgfra-周细胞、Meg3+/Pdgfra+成纤维细胞、Colec11+/Cxcl12+成纤维细胞。最后通过分析数据和过表达/敲除实验证实肌成纤维细胞特异的Nkd2分子可作为肾纤维化的潜在治疗靶点。2021年2月,Hinze等[28]首先通过scRNA-seq技术获得小鼠肾小管单细胞转录组数据,利用肾皮质到髓质渗透梯度不断增加且相邻细胞基因表达相似这一特点,基于novoSpaRc算法重构了肾小管细胞沿皮髓质轴分布的空间排序,并利用RNAscope原位杂交技术对结果进行验证。该结果表明单细胞转录组包含了被低估的空间基因表达和区域细胞状态等信息。然而这种方法并不适用于局部缺血或炎症等损伤的肾组织。2021年6月,Melo Ferreira等[29]构建了缺血再灌注损伤和盲肠结扎穿孔术(CLP)两种急性肾损伤模型,将单细胞测序数据、单核测序数据与Visium空间转录组技术相结合,获得肾组织中免疫细胞和上皮细胞共定位模式,识别了在缺血再灌注损伤模型中由S3近端小管合成的趋化因子Atf3趋化中性粒细胞浸润肾脏外髓,而在CLP模型中则由外皮质近端小管合成的趋化因子Mdk趋化巨噬细胞浸润肾脏外皮层,从而揭示了AKI驱动免疫细胞浸润的发病机制。

前景与展望

从早期出现的原位杂交、原位测序技术,发展到目前基于空间条形码的空间转录组技术,可检测的转录本数量不断扩大,实验过程不断简化,空间信息更加具体,可视化不断加强。虽然目前已商业化的空间转录组学技术仍难以达到单细胞分辨率,少数细胞的表达信息可能会丢失。但是,我们相信随着空间转录组技术的不断改善,以及商业化试剂盒的推广,空间转录组技术在不同疾病研究领域的应用将会越来越广。当前在肾脏领域中,空间转录组技术的应用均是与scRNA-seq相结合,而该技术与蛋白组学、表观遗传学和代谢组学等的整合应用尚未出现,仍有待进一步探索。空间转录组技术的应用,将会大大加快在肾脏组织特定区域细胞分子层面探索疾病发病机制,开发新的分子标志物和治疗靶点的步伐。