申继忠，余武秀

(上海艾农国际贸易有限公司，上海 200122)

1 植物生物刺激剂的定义和类别

欧洲生物刺激剂工业委员会(EBIC)最早给出了生物刺激剂的定义。美国2018年12月颁布的农业法案(2018 Farm Bill)也给出了植物生物刺激剂的定义，Ute Albrecht认为该定义与欧洲生物刺激剂工业委员会的定义基本一致[1]。根据此定义，生物刺激剂有2大类，一类是基于微生物的产品，另一类是基于非微生物类物质产品。非微生物类生物刺激剂产品很多，包括以下几大类：腐殖酸类、海藻提取物及其他植物物质、几丁质和壳聚糖及其他聚合物、蛋白质水解物及其他含氮物质、无机盐(如硅和钴)、复杂有机复合物等[1,2]。生物刺激剂的功效表现在以下几个方面：提高水分利用率、提高养分利用率、促进根结构的发育和生长、增强抗病能力、诱导系统抗性产生、提高植物抗胁迫能力等。

2 蛋白质水解物类生物刺激剂

Giuseppe Colla等充分讨论了蛋白质水解物的生产工艺及其对水解物组成的影响，以及动物源和植物源蛋白质水解物的优缺点等[3]。

蛋白质水解物的种类可以根据来源和生产方法予以分类(表1)[3]。

表1 蛋白质水解物的分类

生产工艺及蛋白质来源对蛋白质水解物的化学特性影响很大。蛋白质在酸性或碱性条件下的化学水解通常是生产动物性蛋白质水解物的首选方法。酸水解是在高温(＞121 ℃)和高压(＞220.6 kPa)下进行的激烈反应。在酸水解中，主要使用盐酸和硫酸水解蛋白质，最常用的是盐酸。碱性水解是一个相当简单和直接的过程，蛋白质在加热条件下溶解，然后添加碱性物如氢氧化钙、钠或钾，并将温度保持在一个理想的设定值。化学水解可以破坏蛋白质的所有肽键，因此蛋白质水解程度较高，游离氨基含量也高，某些氨基酸会被破坏(例如，色氨酸通常被酸水解完全破坏；部分半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸会丢失；天冬氨酸和谷氨酰胺可通过酸水解转化为它的酸性形式)。

此外，其他有用的耐热化合物(如维生素)也大部分在化学水解过程中被破坏。化学水解的另一个关键方面是把游离氨基从L-型转化成D-型(外消旋作用)。由于生物体内蛋白质中的氨基酸都是以L-型存在的，因此植物在代谢过程中不能直接利用D-型氨基酸，故化学水解的蛋白质水解物将减效，甚至对植物构成潜在毒性。最后，大量使用酸/碱水解导致蛋白质水解物的盐度增加。

酶法水解通常用于生产植物蛋白质水解物。酶法水解是通过源自动物器官(如胰酶、胃蛋白酶)或植物(如木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶)或微生物(如碱性蛋白酶、风味蛋白酶)等各种蛋白水解酶进行的。蛋白水解酶水解过程比酸/碱水解温和，不需要高温(＜60 ℃)，通常针对特定的目标肽键发生作用(例如，胃蛋白酶切断含有苯丙氨酸或亮氨酸键的氨基酸链；木瓜蛋白酶切断与精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸相邻的链；胰酶则在有精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的地方切断氨基酸链)。酶解所产生的蛋白质水解物是一种含有不同长度的氨基酸和肽的混合物，含盐度较低，其组成不随时间而变化。

由上可知，通过不同的生产方法获得的蛋白质水解物中，氨基酸含量、肽的含量和分子量分布会有很大不同。

除了氨基酸和肽外，蛋白质水解物还含有其他能起到生物刺激作用的化合物，包括脂肪、碳水化合物、酚类、矿物元素、植物激素和其他有机化合物(如多胺)。例如，在基于紫花苜蓿的蛋白质水解物中发现有两种植物激素(即吲哚乙酸和异戊烯腺苷)，在紫花苜蓿衍生蛋白质水解物中发现有一种刺激植物生长的脂肪醇，即三十烷醇。此外，植物性蛋白质水解物含有在能量代谢和氧化应激防御中起重要作用的可溶性碳水化合物以及酚类物质。相比之下，动物性蛋白质水解物则缺乏碳水化合物、酚和植物激素。矿物含量也受蛋白质来源的影响，通常植物来源的蛋白质水解物含有更多的矿物质，肉粉的蛋白质水解物中存在大量的钠，在植物源蛋白质水解物中有很高水平的镁、锰、铁和锌等营养成分，由皮革作为原材料生产的蛋白质水解物可能含有重金属铬，它作为污染物受到特别关注。

不同来源和不同生产方法获得的蛋白质水解物化学特性的异同点见表2[4]。

表2 基于不同来源蛋白和不同生产方法获得的蛋白质水解物化学特性

3 氨基酸和肽对植物的重要性

近年来，发现植物氮代谢的许多过程和代谢途径明显受到全部或几种氨基酸和酰胺浓度的调控。氨基酸和酰胺在硝酸盐和铵态氮吸收、硝态氮还原、铵态氮掺入、蛋白质代谢和氮再动员中起重要作用。研究表明，游离氨基酸的浓度与植物的氮素状态有关，游离氨基酸可能参与了植物生长和氮素代谢的调控[5]。

氨基酸对植物的抗胁迫能力也有积极影响。受胁迫的植物表现出脯氨酸和其他氨基酸的积累，被积累的氨基酸所起的作用有：作为渗透物、调节离子运输、调控气孔开放和解毒重金属。氨基酸也影响某些酶的合成和活性、基因表达和氧化还原平衡[6]。

蛋白质水解物对植物非生物胁迫有改善作用。非生物胁迫对作物生产产生不利影响，导致其产量下降。在不同的非生物胁迫中，干旱是最重要的一种，因为有限的水分供应对植物的生长和发育有负面影响。Silvana Francesca等研究番茄在有限水分供应下，生物刺激素与关键生理反应机制之间的相互作用，并为提高番茄在干旱胁迫下的性能制定策略。采用一种新型蛋白质水解生物刺激剂(商品名CycoFlow，意大利Agriges公司)，研究了在最优条件(100%灌溉)和有限水分供应(50%灌溉)条件下生长的番茄(基因型E42)的生理反应。与未处理相比，经水解蛋白处理的植株在干旱胁迫下表现出更好的水分状况和花粉活力，产量也更高。生物刺激素处理对叶片和果实中抗氧化物质的含量和活性也有影响。这些研究结果表明，蛋白质水解物应用在有限水分供应时能够改善植株的性能[7]。

氨基酸是所有生物合成蛋白质的重要组成部分，在植物中，游离的“蛋白质源”氨基酸在氮的同化和运输中起着补充的作用，是信号化合物、渗透剂以及制造各种激素、辅助因子和其他主要化合物(如叶绿素)的前体。植物还利用氨基酸的集体作用产生数千种特殊化合物，促进生态相互作用，并对环境胁迫作出适应性反应。

植物中的氨基酸也可以聚合成小肽，通常由 5到60个氨基酸组成。某些小肽在植物生长和发育中起类似激素的作用。另一些则在伤口、病原体感染、营养失衡、干旱或高盐度下发挥作用。

20世纪80年代和90年代，通过从各种植物组织中分离出的膜泡进行吸收测定，开始了对氨基酸和多肽吸收和转运的生化过程研究。利用放射性标记底物和荧光标记方法，揭示了多种氨基酸和肽转运过程的发生。从那时起，在非菌根植物拟南芥中发现了至少12个转运体家族的成员。还有研究揭示了转运蛋白在土壤氨基酸摄取、进出细胞和/或植物维管系统长途运输中的作用[8,9]。

氨基酸在植物中的作用非常之多，各种作用正在不断被发现。目前已知的最重要作用有[10]：⑴ 提高叶绿素产量；⑵ 提供丰富的有机氮来源；⑶ 刺激维生素的合成；⑷ 影响许多酶系统；⑸ 刺激开花；⑹ 促进果实的形成；⑺ 提高产量，改善果实的味道、大小和颜色；⑻ 提高农产品质量；⑼ 增强植物抗性。

肽是由 2～50个氨基酸通过肽键连接而成的分子。超过50个氨基酸组成的分子称为蛋白质。蛋白质的水解不仅能释放氨基酸，还能释放因水解程度不同而含量不同的可溶性肽。软水解，如酶水解，比化学水解产生更多的肽。

肽作为信号分子在植物生理中起着重要的作用，能调节植物防御机制以对胁迫、生长和发育做出反应。肽分子在细胞膜层面起激活植物特定代谢作用[4]。

生物活性肽在农业上具有广泛的应用前景，作为有效的营养和药剂用途已被充分证明，但在解决生物和非生物胁迫、植物病害控制和营养利用效率等农业应用方面尚未受到太多关注。生物活性肽能够增强植物根际分子信号传导，促进结瘤、营养吸收和胁迫管理，可与农药配制，并在叶片处理中通过叶片系统吸收，以实现广泛的植物效益，包括着色、干旱条件下的营养传递、植物健康和作物保护等[11]。

4 蛋白质水解物类刺激剂的功效

蛋白质水解物可影响植物的生长、矿质营养利用、对非生物胁迫的耐受性以及植物的根际微生物群落。蛋白质水解物产品之所以具有这些功效，是因为其含有生长刺激肽和氨基酸，而所含氨基酸是一些植物激素的代谢前体(例如色氨酸是吲哚乙酸的前体，精氨酸是多胺的前体)。蛋白质水解物对植物氮营养也有积极影响，因为氨基酸和肽中的有机氮可以作为植物氮的直接来源，它们可被快速吸收、同化和转运到地上部分。然而，这些氮的使用浓度很低，使用目的不是向作物提供大量的氮素。

蛋白质水解物对植物营养的积极作用还体现在氨基酸和肽能够复合矿物质，提高矿物质的溶解度，从而提升其可利用度。蛋白质水解物特别有利于提高铁、锰、锌等微量元素在碱性环境中的生物有效性。

蛋白质水解物还可以通过激活参与营养吸收的特定根酶来改善作物营养。例如，在根和叶面施用植物源蛋白质水解物可以提升番茄根铁螯合还原酶活性，从而在碱性胁迫条件下增加植物对铁的吸收。但是使用动物源的蛋白质水解物对铁螯合还原酶活性的影响则较小。

蛋白质水解物除了能促进养分的吸收、转运和积累外，还能提高作物对非生物胁迫的耐受性，如不适宜的温度和湿度胁迫、盐度、干旱和弱光条件等。例如，莴苣对低温的耐受性可因为叶面施用蛋白质水解物而提高。蛋白质水解物提高植物对非生物胁迫耐受性的积极作用归因于根系生长更好、根茎比更高、植株营养状况更好、较高的细胞膜稳定性、渗透物(如脯氨酸)和抗氧化剂的积累。

蛋白质水解物可以增加水果的品质，许多氨基酸如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸是芳香化合物的前体，苯丙氨酸是花青素生物合成的前体，精氨酸、丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸是风味的前体物质。

根部使用蛋白质水解物还能刺激土壤微生物的生长，改变微生物区系，有助于提高土壤的整体生物肥力[4,12]。

Christoph Stephan Schmidt等通过盆栽试验，比较了一种新型鸡毛水解物(FH)和一种参考蛋白质水解物(RH)对大麦和小麦的生物刺激作用，研究了它们与丛枝菌根真菌(AMF)和磷的交互作用。结果表明所有试验因素都影响大麦生长，其中 FH增加大麦的茎高和生物量，RH降低茎高和生物量，AMF降低高磷供应下大麦的生物量。在小麦中，AMF处理组的生物量略有降低，而其他因子对生物量的影响不显著。在田间平行试验中，RH和FH对大麦产量和籽粒大小均有提高作用，而2种水解液对小麦均无显著影响。施用时间对水解液效果无影响。两种酶解物在盆栽试验中均能增加大麦网斑病的严重程度，而在田间试验中则能降低网斑病的严重程度。FH促进了低磷条件下AMF在小麦根系的定殖。研究结果表明盆栽测试结果在田间条件下的可转移性有限，并显示了水解产物、土壤磷、植物共生物和病原体之间复杂的相互作用[13]。

为了满足人们对绿色蔬菜日益增加的需求，种植者在高能量投入下种植叶菜作物，尤其是施用高剂量的氮肥。氮肥的过量使用会导致硝酸盐在植物叶片中积累，有时甚至超过了欧洲设置的最高限量。叶片中的硝酸盐可能对人体健康有害，因为在人体内它可以转化为亚硝酸盐，这会导致高铁血红蛋白血症或产生致癌化合物。为了克服这一问题，需要正确的氮素管理，特别是采用提高氮素利用效率的技术手段。Mola(2020)评估了 2种重要的植物生物刺激剂对温室中小叶莴苣产量和品质性状(硝酸盐、抗氧化剂活性和类胡萝卜素)的影响。施氮量分别为0、10 (次优)和20 (最优) kg/hm2，所用生物刺激剂为海藻提取物“Ecklonia Maxima”(3 mL/L)以及豆科植物蛋白质水解物，并设未经处理的对照。海藻提取物和豆科植物源蛋白质水解物的应用提高了产量和叶面积指数(LAI)，比未处理的植物分别提高了13.4%和12.0%；20 kg/hm2氮处理的产量最高。叶面生物刺激素刺激植物抗氧化系统，改善叶片颜色，提高叶绿素和类胡萝卜素含量。在较高施氮水平下，叶片中硝态氮含量增加，在20 kg/hm2氮处理下硝态氮达到欧洲法定限量。因此，在试验条件下，可以通过增加施用生物刺激素来减少氮肥施用量并尽可能降低产量损失[15]。

Gianluca Caruso等在意大利南部评估了2种植物生物刺激剂(豆科植物蛋白质水解物，Trainer®；热带植物提取物，Auxym®)对细叶二行芥的影响。在3个作物周期(秋-冬、冬、冬-春)对叶片产量、光合作用和色泽状况、品质、元素组成、抗氧化剂含量和活性的影响进行评价。这两种生物刺激剂能促进多年生二行芥生长和生产力，冬-春周期的叶片产量高于冬期；能提高叶片干物质、草酸、柠檬酸、钙、磷、酚类物质和抗坏血酸含量及抗氧化活性，但没有增加硝酸盐的含量，冬-春周期诱导的抗氧化活性和各物质含量均高于冬期；这些主要是跟这 2种生物刺激剂含有的氨基酸和可溶性多肽相关，尽管Auxym®也含有少量的植物激素和维生素。另外，这2种植物生物刺激剂都能提高蔬菜产量、营养和功能品质，提高作物产量的机制可能是因为提高了矿物质养分的有效性和吸收[16]。

5 蛋白质水解物生物刺激剂商业化及应用

Moses Madende和Maria Hayes收集整理了一些商业化蛋白质水解物制剂及其蛋白质来源、有效成分、使用方法、应用作物和功效(表3)。从表3可以看出，这些产品来自植物、动物或微生物，其主要成分是氨基酸和肽，还有些产品含有激素和矿物元素，它们多被应用在蔬菜和水果等高附加值作物上[17]。

表3 商业化的生物刺激剂及其组成和使用策略

美国FBN公司推出的植物蛋白质水解物刺激剂产品，声称含有18种氨基酸[18]，产品有效成分以氨基酸和肽计为31%，含有机氮5.0%，有机质总含量35.5%，含可溶性肽形式的氨基酸，游离氨基酸含量少于4%，并声称可用于所有作物(表4)。

表4 生物刺激剂ATARRUS中的氨基酸谱(各种氨基酸所占百分比例)

意大利ILSA S.p.A.公司生产的蛋白质水解物刺激剂产品APR®，在水培条件下将该产品应用于玉米苗，观察对照组和3种不同胁迫(缺氧、盐和营养缺乏)及其组合的条件下玉米苗的变化。结果表明，APR®是可溶性的，能够影响根和茎的生长，影响程度与刺激剂的使用浓度有关。此外，APR®的有效性在单个胁迫或组合胁迫条件下明显提高，从而证实了先前假设的该产品对环境逆境有抵抗能力。此外，它还调节参与硝酸盐运输和活性氧(ROS)代谢的一组基因的转录[19]。

蛋白质水解物可以施用于根或叶面，其用量为1.5～5 L/hm2。一般建议低浓度多次使用，不建议高浓度临时使用。苗期使用蛋白质水解物对幼苗生长有较快的促进作用，还能促进根的生长和植株的快速定植，在生长旺盛的时期通过根和叶面施用则可以加强光合作用，从而促进植物的生长和养分利用效率。特别重要的是，在生产阶段通过叶面使用蛋白质水解物可以提高水果和蔬菜的质量以及食用产品的营养价值。在不利的环境条件下，建议用蛋白质水解物进行预防处理，以增强植物对非生物胁迫的耐受性(例如积累渗透物和次生代谢物)[4]。