潘晓娇 郑春芳 刘伟成 陈继浓 丁文勇

摘要 [目的]探讨钛铁试剂对秋茄幼苗的抗寒性调控作用。[方法]以秋茄幼苗为试材，研究喷洒10 mmol/L钛铁试剂对低温胁迫及恢复后植株叶片光合和叶绿素荧光参数、抗氧化系统以及细胞膜透性的影响。[结果]钛铁试剂能显著提高低温胁迫及恢复后秋茄幼苗叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、PSII最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSII），光化学猝灭系数（qP），抑制非光化学猝灭系数（NPQ）;钛铁试剂也能增加短期低温胁迫及恢复后秋茄幼苗叶片的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，抑制相对电导率以及MDA含量积累。[结论]钛铁试剂能有效改善植株抗氧化系统，提高植株的光合作用，从而增强秋茄幼苗的抗寒性。

关键词 红树林;秋茄;钛铁试剂;低温胁迫;光合作用;酶活性

中图分类号 S 796  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0120-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.030

開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Tiron on Photosynthetic Physiological Characteristics of Kandelia obovata Seedlings under Low Temperature Stress and Recovery

PAN Xiao-jiao1，ZHENG Chun-fang2，LIU Wei-cheng3 et al （1.School of Design and Digital Arts， Zhejiang Industry and Trade Vocational College， Wenzhou， Zhejiang 325000; 2.College of Life and Environmental Science， Wenzhou University， Wenzhou， Zhejiang 325035; 3.Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-resource， Zhejiang Mariculture Research Institute， Wenzhou， Zhejiang 325005）

Abstract [Objective]In order to explore the regulative role of tiron on cold tolerance of Kandelia obovata seedlings.[Method]An experiment was carried out to analyze the effects of 10 mol/L tiron on parameters of gas exchange and chlorophyll fluorescence， antioxidant system and relative electrical conductivity in K.obovata seedling to low temperature stress and recovery.[Result]The results showed that tiron significantly increased leaf net photosynthetic rate （Pn）， stomatal conductance （Gs）， photochemical efficiency of photosystem II （Fv/Fm）， actual photochemical efficiency （ΦPSII）， photochemical quenching coefficient （qP） in K.obovate， while significantly decreased leaf non-photochemical quenching coefficient （NPQ）.In addition， tiron increased the activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD） and ascorbate peroxidase （APX）， and alleviated the oxidative damage in leaves of K.obovata by reducing cell membrane permeability （relative electrical conductivity） and lipid peroxidation （malondialdehyde， MDA）.[Conclusion]The study indicates that tiron could effectively improve the antioxidant system， increase leaf photosynthesis， and enhance cold tolerance of K.obovate seedlings.

Key words Mangrove;Kandelia obovate;Tiron;Low temperature stress;Photosynthesis;Enzymatic activity

秋茄（Kandelia obovata）是我国分布纬度最北，且最耐寒的红树植物之一[1]，被作为向更高纬度引种的最佳红树植物品种之一。低温是影响红树林存活及其生长发育的主要非生物胁迫因子，严重影响秋茄的生长发育和地理分布[2]。近年来，随着全球气候变暖，极端低温发生的频率、强度和持续时间都在不断增加，低温胁迫对红树林产生了极大的伤害[3]。研究表明，低温胁迫会影响秋茄抗氧化系统，提高植株体内活性氧（ROS）含量，抑制叶绿素合成，最终降低植株的光合作用[4-6]。钛铁试剂（Tiron，disodium 1，2-dihydroxybenzene-3，5-disulfonate）是一种非毒性的自由基清除剂[7]，并已经作为植物清除ROS清除剂得以应用[8-9]。研究发现，适宜浓度的钛铁试剂能减轻重金属胁迫对冬珊瑚幼苗根系生长的抑制[10]。然而，关于钛铁试剂调控低温胁迫下红树植物秋茄叶片光合作用和保护酶的研究尚鲜见报道。为此，笔者探讨了叶面喷洒钛铁试剂对低温胁迫下秋茄叶片光合、荧光参数以及抗氧化系统中相关保护酶的影响，探讨ROS清除剂调控秋茄抗寒的机制，以期为我国高纬度引种红树林的安全越冬提供新的途径。F2511C60-F8CE-4E41-9DE6-DA4AA437BE0B

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年4月，从福建漳州购置秋茄胚轴，经消毒后种植在高30 cm直径20 cm并装有3 kg滩涂淤泥自然风干土的聚乙烯塑料桶内，每个桶中插种4株，自然环境下培养，定期浇灌霍格兰氏（Hoaglands）营养液，保持水层1～2 cm。次年（2020年）12月进行低温胁迫试验。

1.2 试验设计

试验设定4个处理：①喷洒清水作为对照（CK）;②喷洒10 mmol/L钛铁试剂（TIR）;③低温胁迫处理（LTS）：喷洒清水+低温;④钛铁试剂缓解低温胁迫处理（TIR+LTS）：喷洒10 mol/L钛铁试剂+低温。每处理3次重复，每个重复3桶。

1.3 试验处理 把植株大小一致的秋茄幼苗移入智能光照培养箱内适应8 d，设定温度为20  ℃（昼）/15 ℃（夜），光照12 h/d，光照强度 400 μmol/（m2·s）。適应结束后，仍保留在光照培养箱（各设定参数均不变）内。把幼苗分为2部分，一部分叶面喷洒清水，另一部分叶面喷洒钛铁试剂溶液。隔天早晚各喷施1次，喷洒以叶面湿润且不下滴为宜，共喷施4 d，共8 d。之后，一半喷施清水和钛铁试剂溶液的植株仍保留在原培养箱（各设定的参数仍与适应时设置一致）内作为对照（CK）和钛铁试剂（TIR）处理，而另一半喷施清水和钛铁试剂溶液的植株转入另一个温度设定为5 ℃（昼）/-1 ℃（夜）冷光源植物生长箱（GDX-260E;除温度外，其他设定参数均不变）内进行低温胁迫处理4 d，其中清水处理的植株为低温胁迫处理（LTS），喷洒钛铁试剂后进行低温胁迫的植株作为钛铁试剂缓解低温胁迫处理（TIR+LTS），光照条件不变。低温胁迫4 d后，温度调整为20  ℃（昼）/15  ℃（夜），LTS和TIR+LTS处理的植株均恢复1 d。分别在低温4 d和恢复1 d选取各处理幼苗顶端完全展开的倒三对叶片进行光合、荧光及生理指标测定。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 光合参数测定。分别在20 ℃和8 ℃光照培养箱内，10：00—11：30利用Li-6400型便携式光合仪（Li-Cor Inc.， USA）测定顶端完全展开的倒三对叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）。测定光合参数时，设定光强400 μmol/（m2·s），CO2供应浓度为390 μmol/mol。

1.4.2 荧光参数测定。在测定光合参数相同的条件下，用英国Hansatech 公司生产的FMS-2型便携调制式叶绿素荧光仪测定叶片荧光参数。测定前先暗适应30 min，然后打开FMS-2的内源光化光[400 μmol/（m2·s）]，5 min 后测定稳态荧光（Fs）、光下最大荧光（Fm′）、初始荧光（Fo）等。依据Rohácˇek[11]方法，计算光适应下实际光化学效率（ФPSII）、暗适应下最大光化学效率（Fv/Fm）、光化学猝灭系数（qP）和非光化学猝灭系数（NPQ）。

1.4.3 生理生化指标测定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）法测定[12];过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定[12];丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定[13]。抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性采用抗坏血酸法测定[14]。

将0.5 g新鲜叶片放入15 mL去离子水中，用抽气机抽气15 min后静置60 min，用DDS211AT型电导仪测定外渗电解质（S1），以沸水煮10 min杀死植物组织为终电导值（S2），并计算相对电导率[15]。

1.5 数据处理 试验数据用软件SPSS 20.0进行方差分析和LSD显著性测验，并采用SigmaPlot 10.0绘图软件作图。数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 钛铁试剂对低温胁迫及恢复后秋茄幼苗叶片相对电导率的影响

由图1可知，低温4 d条件下，与CK相比，TIR处理提高了秋茄幼苗叶片相对电导率，但未达到显著差异水平;LTS处理显著提高了秋茄幼苗叶片相对电导率（P<0.05），为CK的1.6倍;TIR+LTS处理能显著抑制秋茄幼苗叶片相对电导率增加，且叶片相对电导率仅为LTS处理的82.1%。正常条件下恢复1 d，LTS处理秋茄幼苗叶片相对电导率仍显著高于CK，且为CK的1.5倍;TIR+LTS处理仍能显著抑制叶片相对电导率的增加（P<0.05），且叶片相对电导率为LTS处理的84.0%。

2.2 钛铁试剂对低温胁迫及恢复后秋茄幼苗叶片Pn和Gs的影响

由图2可知，低温4 d条件下，与CK相比，TIR处理能提高正常生长条件下秋茄幼苗叶片Pn和Gs，而LTS处理显著降低秋茄幼苗叶片的Pn和Gs（P<0.05）。与LTS处理相比，TIR+LTS处理能显著提高秋茄叶片Pn和Gs（P<0.05）。正常条件下恢复1 d后，LTS处理秋茄幼苗叶片Pn和Gs升高，但仍显著低于CK（P<0.05）;LTS+TIR处理能加速秋茄幼苗叶片Pn和Gs恢复，但与CK相比，仅叶片Pn显著降低（P<0.05），而Gs基本恢复正常。

2.3 钛铁试剂对低温胁迫及恢复后秋茄幼苗叶片POD、APX、SOD活性和MDA含量的影响

由图3可知，低温4 d条件下，与CK相比，正常条件下TIR处理能提高秋茄幼苗叶片POD、APX以及SOD活性，但仅叶片POD和SOD活性与CK存在显著差异（P<0.05）;LTS处理显著降低秋茄幼苗叶片POD和APX活性（P<0.05），而显著增加了SOD活性和MDA含量（P<0.05）。与LTS处理相比，LTS+TIR处理显著提高了幼苗叶片POD、APX、SOD活性（P<0.05），且分别为TIR处理1.3、1.3、1.2倍;LTS+TIR处理反而显著降低MDA含量（P<0.05），且为LTS处理的84.9%。正常条件下恢复1 d，TIR+LTS处理能加速叶片POD活性恢复，并与CK差异不显著;与LTS相比，LTS+TIR处理仍显著提高秋茄幼苗叶片POD、APX、SOD活性（P<0.05），显著降低MDA含量（P<0.05）。F2511C60-F8CE-4E41-9DE6-DA4AA437BE0B

2.4 鈦铁试剂对低温胁迫及恢复秋茄幼苗叶片ФPSII、Fv/Fm、qP和NPQ的影响

由图4可知，低温4 d条件下，与CK相比，TIR处理对ФPSII、Fv/Fm、qP和NPQ均无显著影响（P>0.05）。与CK相比，LTS处理显著降低了秋茄幼苗叶片ФPSII、Fv/Fm、qP，且分别为CK的56.7%、49.0%、43.3%;显著增加了叶片NPQ，为CK的2.2倍。与LTS相比，LTS+TIR处理显著提高了叶片的ФPSII、Fv/Fm和qP（P<0.05），且分别为低温胁迫处理的1.3、1.4、1.5倍，说明钛铁试剂能缓解低温胁迫对秋茄幼苗叶片叶绿素荧光的伤害;LTS+TIR处理反而显著降低叶片NPQ（P<0.05），为LTS处理的67.3%。正常条件下恢复1 d，LTS处理的秋茄幼苗叶片ФPSII、Fv/Fm和qP仍显著低于CK（P<0.05），而叶片NPQ显著高于CK（P<0.05）;LTS+TIR处理有助于秋茄幼苗叶片叶绿素荧光参数（ФPSII、Fv/Fm和qP）的恢复，叶片ФPSII、Fv/Fm和qP分别为LTS处理的1.2、1.3、1.3倍;反而抑制NPQ增加，约为LTS处理的79.1%。

3 讨论

一般来说，在正常情况下，植物细胞内自由基的产生与清除处于动态平衡，而低温胁迫会破坏这种平衡，使大量自由基积累，致使膜脂过氧化程度加剧，导致细胞膜损伤与破坏[16]。其中，抗氧化酶SOD、POD、APX是清除ROS的重要酶类。研究表明，红树植物秋茄叶片相对电导率和MDA含量是衡量植物细胞膜脂过氧化的重要指标[17]。低温胁迫会降低秋茄幼苗叶片POD和APX活性，增加MDA含量和相对电导率，表明低温胁迫导致植物细胞膜受损，膜脂过氧化程度加剧，最终导致秋茄叶片Pn和Gs显著降低[5， 18]。前期研究发现，外施褪黑素[17]、烯效唑[19]以及抗寒锻炼[19]均能通过提高SOD、POD及APX活性，减少MDA含量，增强叶片光合能力，提高秋茄植株抗寒性。该研究中，低温胁迫4 d及恢复1 d均显著降低秋茄幼苗叶片POD、APX活性，增加SOD活性、MDA含量和细胞膜透性，说明低温胁迫能诱导叶片SOD清除超氧阴离子（O2-·）能力，但又因为其清除能力有限，造成ROS大量积累，从而导致MDA含量和相对电导率增加，最终降低叶片Pn和Gs，这与前人研究一致[20]。在低温胁迫和恢复期间，钛铁试剂能提高低温胁迫下叶片SOD、POD、APX活性，抑制MDA含量和相对电导率增加。表明钛铁试剂能提高抗氧化酶，抑制ROS积累，减轻质膜受氧化损伤的程度，提高叶片的Pn和Gs。

叶绿素荧光参数（ΦPSII、qP、Fv/Fm等）是反映植物对光能的吸收、转化、传递等变化的灵敏探针，能够快速、灵敏和无损伤地研究和探测完整秋茄植株在低温胁迫下叶片光合作用能力[21-22]。其中，ΦPSII能反映电子在PSII与PSI的传递情况，Fv/Fm可反映PSII在全开状态时能够达到的最大光能转换效率，qP是光合作用引起的荧光猝灭，反映PSII反应中心的电子传递活性，NPQ用来反映植物耗散过剩光能为热的能力，即光保护能力[23]。 郭菊兰等[24]研究发现，ΦPSII、qP、Fv/Fm值随低温胁迫程度增强而迅速下降，这是反映红树植物响应低温胁迫的重要特征。郑春芳等[25]研究发现，低温胁迫会降低秋茄幼苗叶片ΦPSII、qP，增加NPQ，减轻叶片PSII光抑制，降低光合能力，这与该研究结果一致。该研究还发现，即使在20 ℃（昼）/15 ℃（夜）条件恢复1 d，叶片叶绿素荧光参数（ΦPSII、qP、Fv/Fm、NPQ）均与CK存在显著差异，表明低温胁迫使得电子传递活性受到抑制，光能转化利用率下降，同时也增加PSII吸收的光能转化为热能消耗的比例。外施钛铁试剂能通过调控植物生物碱改善根系生长[7]，至于钛铁试剂是否影响低温胁迫下秋茄幼苗叶片叶绿素荧光参数的变化，目前鲜见报道。该研究中，钛铁试剂能显著增加低温胁迫下秋茄叶片ΦPSII、qP、Fv/Fm，抑制NPQ增加，同时提高了Pn和Gs，而且在20 ℃（昼）/15 ℃（夜）条件恢复1 d时钛铁试剂仍能促进ΦPSII、qP、Fv/Fm恢复。这可能是由于钛铁试剂通过光合功能的改善，使吸收的光能较多地进入光化学过程，有效减少光能的热耗散，提高了叶片Pn和Gs。这表明低温胁迫下钛铁试剂有利于光合色素将捕获的光能转化成化学能，维持较高的PSII光化学活性，提升叶片光合作用，有效缓解低温胁迫对幼苗生长的抑制作用。

综上所述，一定浓度的钛铁试剂能提高SOD、POD和APX活性，降低秋茄幼苗膜脂过氧化产物MDA 含量，稳定了细胞膜结构;钛铁试剂还能提高低温胁迫下秋茄幼苗叶片ΦPSII、qP、Fv/Fm，使光合机构趋于稳定，抑制Pn和Gs下降，缓解低温胁迫对光合系统的损伤，进而提高秋茄叶片光合作用，减轻低温胁迫对植株的伤害。

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