董红红， 赵子闻， 李 腾， 周小峰

(深圳市长隆科技有限公司 迈葳生物事业部，广州 深圳 518116)

化学法和生物法是废水中氮去除的主要方法，其中生物法较为经济有效且不会造成二次污染[1-3].好氧条件下进行硝化反应，缺氧或厌氧条件下进行反硝化反应是传统的生物脱氮过程，由于对环境条件的要求不同，这2个过程不能同时发生，只能依次进行.因此,传统的工艺硝化反应和反硝化反应发生在2个不同的反应池中，这就造成基建投入大.与传统的反硝化菌相比，好氧反硝化菌有着生长迅速、耐有机负荷、脱氮效率高及反硝化反应可发生在好氧条件下等特点[4-7]，避免了硝化和反硝化分离而投入大等缺点.随着经济的高速发展，特别是第三产业的大量引进，污水的类型也在不断增加，其中含盐废水分布最为广泛，与传统的城市污水相比，印染、农药、煤化工、造纸、炼油、海水利用、粮果、制药等行业废水都是高盐废水，水中盐含量偏高[8].水中盐含量高会降低水中微生物体内脱氢酶活性，从而抑制其生长代谢，严重的甚至会造成细菌细胞的质壁分离致其破裂死亡，最终降低脱氮效率[9].因此，开发耐盐反硝化细菌非常必要.近年来，针对特殊环境，国内外研究者开展了大量筛选耐盐反硝化菌株研究，为耐盐菌的筛选奠定了重要基础[10-11].目前，耐盐耐冷氨氧化细菌已被筛选鉴定，在高盐低温的条件下仍具有较好的脱氮效能，之后，耐高氨氮和耐低温特性的菌株也陆续被筛选鉴定[12-13].而能够同时适应高盐废水并具有高效反硝化脱氮性能的菌种较少[8]，因此筛选耐高盐的反硝化菌具有十分重要的意义.

1 材料与方法

1.1 样品来源

所用污泥来自广东惠州某高盐污水处理厂A/A/O处理工艺A池出口,取活性污泥.

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，pH为7.2～7.6.

LB营养培养基的成分及含量：酵母粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH为7.2～7.6.

无机盐培养基：乙酸钠2 g/L，硝酸钾1.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，七水合硫酸亚铁0.05 g/L，氯化钙1 g/L，七水合硫酸镁1.0 g/L，pH为7.2～7.6.

1.3 菌株富集驯化

将5 g的活性污泥接种至硝态氮(0.5 g/L，盐度为10 %)的无机盐培养基中，在30 ℃、盐度为10 %，180 r/min的摇床上培养1 d，得到第1菌液；吸取10 %的第1菌液转接至硝态氮(1.5 g/L,盐度为10 %)的无机盐培养基中，在30 ℃，180 r/min的摇床上培养3 d，得到第2菌液；吸取10 %第2菌液转接至硝态氮(2.0 g/L,盐度为10 %)的无机盐培养基中，在30 ℃，180 r/min的摇床上培养3 d，得到第3菌液.此过程为耐盐反硝化菌的富集驯化过程[14].

1.4 菌株的纯化分离

吸取1 mL驯化后的菌液采用涂布平板法用LB固体培养基进行分离，在30 ℃的恒温培养箱中培养3 d，获得单菌落;采用平板划线法把单菌落分别划线接种至LB固体培养基上，在30 ℃的恒温培养箱中培养3 d，获得单菌落;之后再重复以上操作2次(即划线3)次使其纯化[10].

1.5 菌株的鉴定

对筛选出的菌株进行形态鉴定，将其与《伯杰氏细菌手册》进行对照.对筛选出的菌株做革兰氏染色实验后，用电子显微镜观察其微观形态.使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒对筛选出的菌株DNA进行提取，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rRNA基因序列测序，将测序结果在NCBI数据库中与其他菌种基因序列进行BLAST比对，从而确定所筛出菌株的菌属.下载亲缘关系较近的菌株16S rRNA基因，并同目标菌株通过MAGA 6.0进行亲缘关系分析.

1.6 菌株脱氮效果的影响因素

为了探究不同菌株反硝化脱氮效果，选取从活性污泥中筛选出的3株耐盐反硝化菌HX-1，IL-3和YFX-6，作为研究对象，设置菌剂添加量为20 %，在好氧环境中对提升盐度10 %的粮果废水进行16 h处理，并测定硝态氮脱除效率.反应前粮果废水的硝态氮含量为110.41 mg/L，总氮含量为122.01 mg/L.以乙酸钠为碳源，将菌株接种到不同C/N质量浓度比的某粮果废水中，提升盐度10 %，投加量为20 %，反应16 h，考察不同C/N质量浓度比对菌株脱氮效果的影响，测定初始和结束时粮果废水的硝态氮；将菌株接种到某粮果污水中，盐度提升10 %，在不同的溶解氧条件下培养16 h，考察不同溶解氧对菌株脱氮效果的影响，测定初始和结束时粮果废水的硝态氮.将不同量的菌株接种到某粮果污水中，盐度提升10 %，培养16 h，考察不同接种量对菌株反硝化脱氮效果的影响，测定初始和结束时粮果污水的硝态氮；将菌株接种到粮果废水中，在盐度10 %的条件下培养不同的时间，考察不同处理时间对菌株脱氮效果的影响，测定初始和结束时市政污水的硝态氮.

1.7 测定方法

采用水质硝酸盐氮紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)测定反应前后的硝态氮.

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选与鉴定

a.在平板培养基上的菌落形态； b.革兰氏染色后在油镜下的形态.图1 菌株YFX-6的形态特征Fig.1 The Morphological Characteristics of Strain YFX-6

从该污水处理厂A/A/O处理工艺反应池出口活性污泥中共筛选出3株耐盐反硝化菌，分别命名为HX-1，IL-3,YFX-6，其中仅有YFX-6在30 ℃下对硝态氮的去除率可达90 %以上.在固体培养基上进行多次划线分离，挑选生长形态特征较好的单菌落进行观察和革兰氏染色，菌落形态如图1所示.菌落呈规则形状，圆凸透明，大小统一，直径2～4 mm，表面湿润，边缘平整，革兰氏染色为阴性，具有运动性，兼氧生长.菌株生长温度为20～35 ℃，pH为6.0～9.0.最适生长温度为30 ℃，pH为7.5.通过油镜观察，该菌是长杆菌.通过测序,把该株菌的16S rRNA序列同NCBI数据库进行BLAST比对，显示YFX-6菌与TG67盐单包菌(DQ994161.1)的序列相似度为100 %.将亲缘关系较近的菌株的同基因通过MEGA 6.0进行亲缘关系分析，如图2所示.通过生物学鉴定和系统发育树分析后，初步确定该菌株为盐单胞菌(Halomonassp.).

图2 菌株YFX-6及部分盐单胞菌属菌株的NJ系统发育树Fig.2 Phylogenetic NJ Tree of Strain YFX-6 and Some Halomonas Strains

2.2 不同菌株对硝态氮的去除效果

图3 菌株HX-1,IL-3和YFX-6分别 对高盐度废水的硝态氮去除情况Fig.3 The Removal of Nitrate Nitrogen from High-salinity Wastewater by Strain HX-1,IL-3 and YFX-6,Respectively

如图3所示，3株反硝化菌选择添加量占总体积的20 %，处理16 h时，YFX-6菌已在好氧环境中，对粮果高盐(10 % NaCl)废水处理16 h时的硝态氮脱除效率达到98.54 %，此时硝态氮质量浓度为1.68 mg/L.而HX-1菌与IL-3菌反硝化性能显著低于YFX-6菌，硝态氮处理效率分别为75.69 %和85.33 %.因此，YFX-6菌的脱氮效果更优，可进行后续研究.从图3中可以看出，YFX-6菌的脱氮效果远远高于HX-1菌与IL-3菌.

2.3 C/N质量浓度比的影响

碳源是影响硝化过程的重要因素，反硝化细菌多为异养型细菌，异养反硝化细菌可以以有机物为碳源，硝态氮为能源进行反硝化作用，其生化过程为5CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2↑+4N2↑+8OH-+能量.碳源浓度的高低影响着反硝化作用的进程.如图4所示，在YFX-6菌株添加量为20 %，溶解氧(DO)为3.5 mg/L的环境中好氧反应16 h，以乙酸钠为碳源，分别对C/N质量浓度比为2，4，6，8和10的硝态氮的去除效果进行考察，结果显示碳氮质量浓度比越高，硝态氮和总氮的脱除速率越大.C/N质量浓度比为2，4，6，8和10处理后的硝态氮质量浓度分别为58.52，33.08，14.23，3.87和10.40 mg/L.YFX-6菌利用NO2-和NO3-为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮(N2)，其脱氮作用过程：NO3-→NO2-→N2↑.C/N质量浓度比为2，4和6时，碳源相对不足，硝态氮及总氮浓度相对较高，其中硝态氮脱除效率分别为47.04 %，70.06 %，87.12 %.碳氮质量浓度比为8时，碳源浓度适宜，此时硝态氮和总氮脱除效率分别达到96.49 %和90.92 %，处理后质量浓度分别为3.87，11.09 mg/L，碳氮质量浓度比为10时，碳源较为充足，硝态氮和总氮脱除效率反而有所降低，为90.58 %和86.15 %，在实验进行中亚硝态氮质量浓度均低于0.36 mg/L，氨氮处于1.07～2.92 mg/L.

2.4 溶解氧的影响

如图5所示，从评价结果来看，对比80 r/min(ρ(DO)=1 mg/L)，120 r/min(ρ(DO)=2 mg/L)，150 r/min(ρ(DO)=2.8 mg/L)，180 r/min(ρ(DO)=3.5 mg/L)及230 r/min(ρ(DO)=4.5 mg/L)5个处理组可以看出，随着摇床转速的增加，硝态氮和总氮的去除率逐渐提高，当转速为180 r/min，相应的ρ(DO)为3.5 mg/L，硝态氮和总氮的去除率分别为97.28 %,90.20 %，处理后的硝态氮质量浓度为2.99 mg/L，总氮浓度为11.92 mg/L；摇床转速继续提升到230 r/min，相应的ρ(DO)为4.5 mg/L，硝态氮和总氮的去除率分别为97.88 %和91.33 %，处理后的质量浓度分别为2.33，10.55 mg/L，所有处理组中亚硝态氮和氨氮质量浓度分别低于0.42，2.96 mg/L，该菌反硝化性能较好，但氨氧化性能不明显.综合考虑，性价比最高的摇床转速为180 r/min，ρ(DO)为3.5 mg/L.

图4 C/N质量浓度比对菌株FX-6去除硝态氮 和去除总氮的影响Fig.4 The Effect Mass Concentration Ratio of C/N on the Removal of Nitrate Nitrogen and Removal of Total Nitrogen by Strain FX-6

图5 不同转速对菌株FX-6去除硝态氮和 去除总氮的影响Fig.5 The Effect of Different Speeds on the Removal of Nitrate Nitrogen and Removal of Total Nitrogen by Strain FX-6

2.5 接种量的影响

在盐度为10 %的水体中，盐含量会抑制水中微生物的活性.因此，水体中菌种的初始投加量对其硝态氮脱除效果影响较大.在C/N质量浓度比为8，分别投加菌液5 %，10 %，15 %，20 %，25 %和30 %(体积分数)，对粮果废水处理16 h，ρ(DO)保持为3.5 mg/L的条件下，观察接种量对菌株FX-6去除硝态氮和总氮的影响，见图6.结果表明，当菌株添加量为5 %～15 %时，菌株投加量越大，硝态氮和总氮脱除效率越高；当添加菌株体积分数为20 %时，YFX-6菌脱氮效率较高，性价比最高，其中硝态氮去除率为97.09 %、总氮去除率为90.36 %，此时硝态氮和总氮质量浓度分别为3.23，11.79 mg/L；继续增加菌株体积分数为25 %和30 %时，总氮去除率提升不明显，硝态氮去除率提升也较低，在添加菌株体积分数为25 %和30 %时硝态氮去除率分别为97.12 %和97.33 %，处理后质量浓度分别为3.20，2.96 mg/L.当添加不同体积分数的菌株时各组亚硝态氮质量浓度均较低，最高值仅为0.47 mg/L.各组氨氮去除效果不明显，其含量为1.21～2.44 mg/L，体现出该菌不具备明显的氨氧化能力.

2.6 处理时间的影响

反硝化时间也是影响硝态氮和总氮去除率的一个重要因素，时间过短，反硝化进行不彻底；时间过长，反硝化进行完全，但成本增加.在添加YFX-6菌株体积分数为20 %，ρ(DO)为3.5 mg/L的条件下分别考察0，5，10，13，16，19和23 h的硝态氮和总氮去除效果，实验结果见图7，可以看出，硝态氮和总氮的去除率均随着时间的增加逐渐升高.其中，处理16 h时，YFX-6菌脱氮效率最高，硝态氮和总氮的去除率分别为98.69 %和92.36 %，此时硝态氮和总氮质量浓度分别为1.45，9.39 mg/L；不同处理时间组中氨氮的质量浓度为1.79～2.91 mg/L，该菌氨氧化性能不明显，亚硝态氮质量浓度也都低于0.39 mg/L，未发现亚硝态氮积累现象.从性价比综合考虑，16 h为最佳的反应时间.

图6 接种量对菌株FX-6去除硝态氮和总氮的影响Fig.6 The Effect of Inoculation Amount on the Removal of Nitrate Nitrogen and Total Nitrogen by Strain FX-6

图7 不同处理时间对菌株FX-6去除 硝态氮和总氮的影响Fig.7 The Effect of Different Treatment Time on the Removal of Nitrate Nitrogen and Total Nitrogen by Strain FX-6

3 结 论

本实验从某污水处理厂A/A/O处理工艺反应池出口活性污泥中筛选出一株耐盐异氧反硝化菌YFX-6，经系统发育树分析表明其与盐单胞菌(Halomonassp)同源性较高，且为革兰氏阴性菌.所筛选出的3株耐盐菌中YFX-6菌硝态氮去除效果最好，其对硝态氮质量浓度为110.41 mg/L的高盐粮果废水处理16 h后脱氮效果为98.54 %，此时硝态氮质量浓度为1.68 mg/L.在碳氮质量浓度比为8时，硝态氮和总氮的脱除效率最高，分别达到96.49 %和90.92 %；溶解氧质量浓度为3.5 mg/L时，YFX-6硝态氮和总氮去除率已达较高水平，分别为97.28 %和90.20 %；接种菌株体积分数为20 %时综合性价比最高，YFX-6菌硝态氮去除率为97.09 %，总氮去除率为90.36 %，处理16 h时该菌硝态氮和总氮达最高去除率，分别为98.69 %和92.36 %.

与传统的缺氧/厌氧反硝化菌相比，好氧反硝化菌具有生长繁殖快、耐有机负荷、脱氮效率高、对环境的适应能力强，反硝化反应可发生在好氧条件下等特点，在高盐废水的脱氮应用方面具有很大意义.本研究筛选出的好氧耐盐菌YFX-6能在高盐含量(10 %盐度)的废水中生长繁殖并在好氧条件下发挥出较好的脱氮性能，这对高盐废水总氮的处理具有重要意义.