王俊凯　邓勋　邵鹏　宋小双　宋瑞清

摘要 木霉与根际促生细菌在土传病害生物防治上具有巨大潜力。该试验在兼容性筛选基础上，研究了绿木霉（Trichoderma virens）ZT05与双向伯克霍尔德氏菌（Burkholderia ambifaria）ZB155在离体条件下，发酵液代谢产物对互相的生长、孢子萌发、生物膜形成及拮抗活性方面的影响，并进行了离体共培养体系构建的初步研究。结果表明：菌株ZT05与ZB155离体条件下具有良好的兼容性。在离体互作研究中，两个菌株在对互相的生长、孢子萌发、生物膜形成及对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的拮抗作用中表现出良好的兼容性。在活体共培养中，对病原菌的抑制作用同单接种处理差异显著，其中对峙培养抑制率为38.10%，发酵液抑制率为76.67%，优势明显。因此，菌株ZT05与菌株ZB155互作在生防作用上具有巨大潜力。

关键词 绿木霉;双向伯克霍尔德氏菌;共培养;互作机制

中图分类号：S718.8 文献标识码：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2022.04.001

Interaction Mechanism Between Trichoderma virens and Burkholderia ambifaria in Vitro

Wang Junkai Deng Xun Shao Peng Song Xiaoshuang Song Ruiqing

（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang; 2. Heilongjiang Academy of Forestry Sciences，Forest Conservation Research Institute，Harbin 150040，Heilongjiang;3. Heilongjiang Key Laboratory of Forest Grassland Fire and Pest control，Harbin 150040，Heilongjiang）

AbstractTrichoderma and rhizosphere growth-promoting bacteria have great potential in the biological control of soil-borne diseases，but the mechanism of interaction between them is less studied. On the basis of previous compatibility screening，the effects of metabolites from the fermentation broth of Trichoderma Virens ZT05 and Burkholderia ambifaria ZB155 on mutual growth，spore germination，biofilm formation and antagonistic activity

in vitro were studied. A preliminary study on in vitro co-culture systems was also carried out. The results showed

that strain ZT05 had good compatibility with ZB155 in vitro. In the study of in vitro interaction，the two strains showed good compatibility to each other's growth，spore germination，biofilm formation and antagonism to Rhizoctonia solani. In the co-culture in vivo，the inhibition of pathogens was significantly different from that of single inoculation. The inhibition rate of confrontation culture was 38.10%，and that of fermentation liquid was 76.67%，showing obvious advantages. In conclusion，the interaction between strain ZT05 and strain ZB155 has great potential in biocontrol，and this study lays a foundation for further studies on the interaction of compound biocontrol bacteria，plant-pathogen.

Key wordsTrichoderma virens;Burkholderia ambifaria;co-culture;interaction mechanism

根際促生细菌（PGPRs，plant growth promoting rhizobacteria）是指定殖于植物根际并能够促进植物生长的细菌[1]。主要通过生物固氮作用、分泌激素、产生铁螯合载体、解磷作用等提高植物根际养分吸收能力[2]来提高植物耐旱性、提高产量、促进生长[3-5]。其中，伯克霍尔德菌属（Burkholderia）作为优良的促生抗逆菌属，其菌属的大部分物种拥有许多对植物、环境有益的功能，如生物修复、固氮、促生、诱导植物抗性等[6]，具有多种抑制植物病原真菌活性的功能，能有效抑制黄瓜、胡椒、大豆、草莓和番茄中的尖孢镰刀菌（ Fusariumo xysporum） 、终极腐霉菌（ Pythium ultimum） 、立枯丝核菌（ Rhi-zoctonia solani） 和齐整小核菌（ Sclerotium rolfsii） 等[7]土传真菌。在生防作用上具有巨大潜力。因此，双向伯克霍尔德氏菌属越来越受到关注，并成为植物根际促生菌的一个研究热点菌属。BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

木霉（Trichoderma spp.）是一种广为人知的土传真菌，在土壤中很常见，能在植物表面和内部定殖为内生真菌[8]，无处不在且高度多样化。研究表明，木霉可以通过竞争营养物质和空间，利用低浓度营养物质来占领病原菌侵入点[9]，也可主动识别病原菌，以重寄生方式杀死寄主[10]及挥发代谢产物来达到抗生作用[11]。其中，绿木霉（Trichoderma virens）作为木霉的一种，在樟子松促生、抗病方面具有巨大潜力[12，13]，通过竞争营养物质和空间、改变环境条件、促进植物生长、形成植物防御机制和抗生作用，或直接通过真菌寄生等机制对真菌致病菌进行生物防治[14]。

现代农林业的发展要求减少化学药剂的使用，以多种有益微生物复合使用，同时发挥促生抗逆和土壤修复功能的复合生物菌剂逐渐取代单一菌剂成为未来生物菌剂研究发展的方向，同时复合菌剂的使用可以保障益生菌在多样的土壤和环境条件下保持高效率、可靠性和一致性[15]。而不同益生菌的兼容性是对植物促生抗病协同增效作用的关键因素[16]。Velmourougane等[17]通过调节细菌-木霉共培养体系条件下培养基比例与接种顺序，成功证明了细菌-木霉共培养体系在提升生物量、生物膜形成、拮抗能力及胞外多糖方面的能力。证明了木霉-细菌共培养体系作为一种多功能植物生长促进剂和土壤肥力促进剂在土壤肥力研究中的应用。然而，建立共培养体系的微生物之间存在直接或间接的相互作用，可能对生物防治效果产生消极或积极的影响。因此，在两种生防菌的组合下，生防活性与个体活性相比可以提高、降低或相近[18]。所以，如何筛选出兼容且适合的品种，决定着共培养体系能否成功构建。

在此背景下，本试验采用从樟子松根际分离筛选得到双向伯克霍尔德氏（Burkholderia ambifaria）菌株ZB155，通过与多种优秀的生防木霉菌种进行兼容性评价，进行离体互作的分析及共培养体系的构建来探究其在生防作用上的潜力。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株：双向伯克霍尔德氏（Burkholderia ambifaria）菌株ZB155、绿木霉（Trichoderma vi-rens）ZT05和T43、哈茨木霉（T. harzianum）T101和T14、绿色木霉（T. viride）5436、立枯丝核菌SH，其中菌株ZB155、ZT05、T101分离自辽宁省章古台樟子松人工林根际土壤，菌株T14、5436、SH分离自黑龙江省苇河林业局苗圃，菌株T43引自以色列。上述菌株保存于黑龙江省林业科学院森林微生物实验室。

1.2 菌株培养方法

将-20 ℃保存的菌株ZB155接种在牛肉膏蛋白胨（NB）培养基中，28 ℃、150 r·min^-1振蕩培养48 h后，将发酵液12 000 r·min^-1离心10 min取上清。经0.22 μm过滤膜过滤除菌，得到无菌的ZB155发酵液。

将4 ℃保存的木霉ZT05接种在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，25 ℃静置培养。4 d后用无菌打孔器（直径10 mm）切取菌饼，接种于盛有150 mL PD培养基的250 mL锥形瓶中，每瓶接种3个菌饼，25 ℃、150 r·min^-1振荡培养4 d。将培养好的发酵液过滤去除菌丝并在12 000 r·min^-1下离心10 min，将发酵液经0.22 μm过滤膜过滤除菌，得到无菌的木霉ZT05发酵液。

木霉ZT05孢子悬液制备：参照陈臻等[19]的方法，将木霉ZT05活化后接种在PDA培养基上，25 ℃静置培养7 d后，在平板中加入10 mL无菌水，用无菌接种环轻轻刮取，将表面孢子洗脱。无菌水稀释后用血球计数板测定，调节孢子液浓度为1.0×10⁶cfu·mL^-1。

1.3 木霉与促生细菌ZB155兼容性测定

采用对峙培养方法分别测定5株木霉（包括ZT05、T101、T43、T14、5436）与促生细菌ZB155的兼容性。

参照尹大川等[20]的方法，采用平板对峙培养法：在距PDA平板中央2.5 cm处接种4个10 μLZB155菌液液滴，28 ℃静置培养。24 h后在PDA平板中央接种木霉，25 ℃静置培养。以未接种细菌为空白组，当空白组木霉菌落长满平板时，测量处理组的木霉菌落直径，并计算抑制率，每个处理3次重复。

抑制率（%）=细菌菌落中心至真菌菌落边缘距离/细菌菌落中心至真菌菌落中心距离×100

1.4 ZB155发酵液对ZT05生长及生防作用的影响

在前期兼容性测定试验中，筛选出了具有与菌株ZB155共培养可能性的木霉菌种，在离体条件下测定ZB155发酵液胞外代谢产物对木霉生长及拮抗活性的影响。

1.4.1 对ZT05菌丝生长的影响 将0.22 μm过滤除菌的ZB155发酵液按照1%、5%、10%、20%、30%（V∶V），5个浓度梯度分别加入PDA培养基中，将木霉ZT05接种于平板中央。以不添加ZB155发酵液为对照处理，25 ℃下静置培养，在培养48 h和96 h时测量菌落直径，每个处理3次重复。

1.4.2 对ZT05孢子萌发的影响 参照陈雨等[21]的方法，菌株ZT05孢子悬液经含上述1%、5%、10%、20%、30%（V∶V），5个不同浓度ZB155发酵液的0.1%吐温80溶液处理6 h后，调节孢子浓度至1.0×10⁵cfu·mL^-1后接种于无菌水-琼脂培养基平板中，25 ℃静置培养24 h后，在光学显微镜40倍镜条件下观察分生孢子萌发情况，计算萌发率。

1.4.3 对ZT05拮抗活性影响BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

按照上述方法，将经ZB155发酵液处理的ZT05菌株孢子液接种在PDA平板中，进行平板对峙试验。

平板对峙试验中，将立枯丝核菌SH接种在平板中央，在距中心2.5 cm处接种4个10 μLZT05孢子液滴（1×10⁶cfu·mL-1），25 ℃静置培养4 d。以不接种ZT05为对照组，测量平板中央SH病原菌的菌落直径并计算抑制率。

抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100

1.5 ZT05发酵液对ZB155生长及生防作用的影响

1.5.1 对ZB155生长的影响 在牛肉膏蛋白胨（NB）培养基中分组添加上述1%、5%、10%、20%、30%（V∶V）5个浓度梯度的木霉ZT05发酵液，以不添加发酵液组为空白对照。28 ℃下震荡培养48 h后测量OD₆₃₀值。

1.5.2 对ZB155生物膜形成的影响 参照 O'Toole[22]的方法，使用结晶紫法检测生物膜形成。在牛肉膏蛋白胨（NB）液体培养基中按上述1%、5%、10%、20%、30%（V/V）5个浓度梯度加入木霉ZT05的发酵液，以不加入发酵液为对照，每组3次重复，最终测量OD₅₅₀值。

1.5.3 ZB155拮抗活性的影响 按上述方法，将ZB155经含有上述浓度ZT05发酵液的1%的吐温80溶液中处理1 h后，进行拮抗对峙试验。先将4个10 μLZB155菌液接种在距平板中央2 cm处，培养24 h。再在平板中央接种SH，25 ℃下静置培养4 d，培养后测量病原菌菌落直径，测量抑制率，并测量抑菌带宽度。

1.6 共培养体系对立枯丝核菌的抑制作用

在系统研究木霉ZT05与促生细菌ZB155相互作用的前提下，探究在共培养体系条件下木霉ZT05与促生细菌ZB155对立枯丝核菌的抑制作用。

1.6.1 对峙培养对立枯丝核菌的抑制作用

分别设置单独接种ZT05、ZB155及共接种ZT05和ZB155等3个接种处理，将培养好的ZB155菌液（1.0×10⁸cfu·mL^-1）与ZT05孢子悬液（1.0×10⁶cfu·mL^-1）10 μL按照上述接种处理接种在距离PDA平板中心2.5 cm的一端，在另一端距接种点5.0 cm处接种病原菌SH菌饼。在28 ℃下静置培养4 d，测量病原菌菌落直径并计算抑制率。

1.6.2 发酵液对立枯丝核菌的抑制作用 按照K.Velmourougane的方法[23]，使用PD75∶NB25液体培养基（PD与NB比例为75∶25），提前接入10 μLZT05孢子悬液（1×10⁶cfu·mL-1），25 ℃震荡培养，48h后接种10 μL ZB155菌液（1.0×10⁸cfu·mL^-1）振荡培养48 h。培养后的发酵液过滤后以1 200 r·min^-1离心10 min获取上清液，并经0.22 μm过滤膜过滤除菌，便得到ZT05与ZB155共培养体系的发酵液。

平板对峙：在PDA培養基中添加20%浓度的共培养发酵液，以不添加发酵液组为空白对照。平板中央接种SH，以不同浓度处理为对照组，在25 ℃下静置培养至空白组菌丝长满平板后，测量对照组菌落半径并计算抑制率。

1.7 数据统计与分析

数据采用 Excel 2019 软件进行初步处理，数据由平均值±标准误（mean±SE）表示，每个指标设置 3 个重复。使用 SPSS19.0 统计学分析软件对菌株生长、生物膜形成、抑制率进行单因素方差分析，使用 Origin 2019软件处理数据并绘图。

2 结果与分析

2.1 兼容性测定

5种木霉与促生细菌ZB155的体外共培养4 d后，测定不同处理木霉菌落直径，计算抑制率。由表1和图1可知，菌株ZT05的抑制率为4.67%，与菌株ZB155的兼容性最好，与其他4种木霉抑制率相比存在显著性差异（P<0.05），木霉ZT05菌落与细菌ZB155的菌落之间没有明显抑制带，且菌落接触后可绕过细菌菌落继续生长。

2.2 木霉与促生细菌的离体互作

2.2.1 ZB155发酵液对ZT05的影响

（1）对菌丝生长和孢子萌发的影响。ZB155发酵液代谢产物对ZT05菌落具有抑制作用。由图2可以看出，菌株ZT05培养48 h时，不同浓度梯度之间ZT05生长存在显著差异（P<0.05），但在培养96 h后，低浓度（1%～10%）之间差异减小，且均与空白对照无显著差异，只在高浓度（20%～30%）处理下，存在显著差异（P<0.05）。

结果表明菌株ZT05对ZB155发酵液代谢产物具有一定的适应性，但在高浓度条件下，ZB155发酵液代谢产物对ZT05的生长仍会产生抑制，抑制率为34.63%。

在孢子萌发方面，经过ZB155发酵液处理过的ZT05孢子在琼脂平板上培养24 h后萌发率接近90%，因此，ZB155发酵液对ZT05孢子的萌发无抑制作用。

（2）拮抗作用。ZT05孢子经过1%～20%的ZB155发酵液处理6 h后，ZT05的拮抗活性并没有出现显著差异，其对立枯丝核菌的生长抑制率为68.96%～76.58%，见图3。

其中当ZB155发酵液浓度为30%时，抑制率为66.81%，与空白组差异显著（P<0.05），ZB155发酵液对ZT05的拮抗活性产生了抑制作用，见图4。

2.2.2 ZT05发酵液对ZB155的影响BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

（1）对ZB155生长的影响。用不同浓度（1%～30%）的ZT05发酵液加入NB培养基后，ZB155产生了不同程度的增长，其中在浓度为20%时OD₆₃₀最大值为0.584 3，20%以后促进作用逐渐变缓，但较空白组仍有显著差异（P<0.05）。可见ZT05的发酵液对ZB155生长起到了促进作用，且这个作用在前期会随着浓度增加而增加，在浓度为20%时达到最高，见图5。

（2）对ZB155生物膜的影响。

ZT05发酵液的添加对ZB155细菌生物膜的形成具有抑制作用，培养48 h后，1%～30% ZT05发酵液添加浓度处理，生物膜OD₅₅₀值为0.282 7～0.312 1。同对照处理OD₅₅₀值0.315 6相比，低浓度（1%～20%）时无显著差异，高浓度（30%）时差异显著（P<0.05），见图6。

（3）对ZB155拮抗活性的影响。

不同ZT05发酵液浓度梯度处理后，菌株ZB155对立枯丝核菌的抑制作用无显著性差异，对SH的抑制率为68.52%～71.06%（图7）。通过观察抑菌带也可发现，宽度均为0.25 cm左右，没有明显差异（图8）。说明ZT05发酵液对ZB155的拮抗活性没有影响。

2.2.3 共培养体系对立枯丝核菌的抑制作用

（1）对峙培养对立枯丝核菌的抑制作用。和单独对峙培养相比，活体共培养可显著提高对立枯丝核菌生长的抑制作用，其中单独接种ZT05菌落对峙的抑制率为28.57%，单独接种ZB155菌落对峙时的抑制率为14.29%，ZT+ZB处理组的抑制率为38.10%，均形成显著差异（P<0.05），见图9。

（2）发酵液对立枯丝核菌的抑制作用。

由图10可看出，ZT05与ZB155液体共培养发酵液（20%添加浓度）可显著提高对立枯丝核菌生长的抑制作用，抑制率为76.67%，与其他两组单独培养发酵液处理相比，差异显著（P<0.05）

3 讨论

3.1 兼容性分析

良好的菌株兼容性对成功建立木霉与促生细菌共培养体系至关重要，可起到协同增效的作用，否则由于菌种之间的相互竞争与抑制作用，会导致共培养体系生防水平的下降。

本试验采用对峙培养法，根据抑菌圈大小、菌落直径变化程度和菌落形态有无变化等[24]，初步了解对峙效果后，通过计算抑制率进行优良兼容性木霉菌株的筛选。经计算，菌株ZT05与菌株ZB155的兼容性最好，但抑制率仅为4.67%，显著低于其余4个木霉菌株。对峙培养条件下，木霉菌株ZT05可以在细菌菌落周围正常生长，随着培养时间增加，木霉与细菌之间抑菌带不明显，甚至覆盖细菌菌落，其他木霉菌株不仅会形成明显抑菌带，而且生长受到抑制，并且随着对峙培养时间增加，生长逐渐停滞。因此，在兼容性分析中筛选出具有共培养可能性的ZT05+ZB155组合，为进一步研究互作机制打下良好基础。

3.2 木霉与促生细菌的离体互作研究

本部分进行了促生细菌ZB155的发酵液与木霉ZT05发酵液对对方在生长及生防作用能力影响上的离体互作研究。因为微生物生防制剂的成功在很大程度上取决于引入的微生物主动在目标定殖的能力[25]，比如根际促生细菌（PGPR）生物膜的形成就与根部定殖有关。PGPR在根系分泌物浓度较高的地方形成微菌落或生物膜。在这些生物膜中，细菌之间相互沟通，以协调一致的方式发挥作用，并与抗性的诱导有关[26]。所以，除了通过与病原菌立枯丝核菌进行对峙培养以外，还对木霉ZT05的分生孢子萌发率及促生细菌ZB155的生物膜形成情况也进行了分析。

菌株ZB155发酵液对ZT05的生长和对立枯丝核菌的拮抗能力产生了抑制作用，但并没有影响孢子萌发率。ZB155对ZT05的抑制效果与添加发酵液的浓度有关，在高浓度处理（20%～30%）中产生显著的抑制作用，而在的低浓度处理（1%～10%）中，抑制作用不显著。对峙培养中，经高浓度ZB155发酵液处理的木霉ZT05菌株对立枯丝核菌的抑制率下降，与低浓度及空白处理产生显著差异（P<0.05），其原因也与ZT05的生長有关。经发酵液处理的ZT05菌落较稀疏，明显是受到了生长方面的抑制作用，而木霉主要的拮抗作用便来自于竞争和寄生作用，当ZT05本身的生长受到抑制时，其对病原菌的抑制效果也会受到影响。

菌株ZT05发酵液对ZB155的生长具有促进作用，对病原菌的拮抗作用无影响。木霉ZT05发酵液胞外代谢产物低浓度处理（1%～20%）后，促生细菌ZB155生物膜形成同对照相比无显著差异（P>0.05），在对峙培养中，菌株ZB155对病原菌的拮抗作用并未受到影响。

综合分析，菌株ZT05和ZB155的互作中，以相互促进为主，只在高浓度处理中才表现出抑制作用，考虑到木霉的抗菌化合物在自然条件下的浓度远低于本研究使用的浓度[27]，因此上述结果可以为接下来的活体共培养体系的建立打下基础。

3.3 共培养体系的立枯丝核菌的抑制作用

共培养（co-culture）是在一个培养容器中一起培养两种或多种微生物的方法。共培养可以在液体或固体培养基中进行。当使用液体培养时，该方法也称为 “混合发酵”[28]。共培养体系与之前离体互作的区别在于，离体的互作更多是探究菌物之间胞外代谢产物的相互影响，并且从空间上讲，两者是分开独自培养在自己的最适环境中。然而共培养体系会更加复杂，因为共培养体系的成功不仅取决于生防菌的个体能力，还取决于它们之间的相互作用[29]。

实验结果表明，当木霉ZT05与促生细菌ZB155活体共培养时对立枯丝核菌SH的拮抗活性增强，其中共培养体系发酵液对立枯丝核菌的抑制效果显著。活体共培养时，ZT+ZB处理与ZT或ZB单独处理组对比时，抑制率均有显著提高（P<0.5）。可以看出，ZT05在加入ZB155共培养后ZB155对其生长产生一定抑制，导致其菌落明显比单独接种时稀疏，菌落直径减小，但抑制率却不降反升。原因是ZB155虽减少了ZT05与SH的营养竞争能力，但自身也分泌了更多的胞外代谢产物，产生拮抗性，这两方面因素均发生作用。从结果看，促进的作用要强于抑制的作用，这在后来的发酵液培养中也得到了证明。木霉活体抑制率较高，而发酵液抑制率较低，因为其主要的拮抗作用还是来自于活体的营养竞争。相反，促生细菌ZB155发酵液抑制率相比活体抑制率较高，是因为其主要靠胞外代谢产物产生抑菌作用。所以将ZT与ZB在适当的浓度比例共培养后，无论是活体对峙培养还是发酵液对峙培养，都比单独接种有更高的抑制率。这也证明，在共培养体系的条件下，的确是达到了“1+1>1”的效果，但是否是“1+1>2”，还需要更加深入的研究。BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

为了更好地了解这些微生物在根际的相容性，还需要进一步的接种试验，并且在共培养体系的构建上需要进一步优化培养基组合、温度、共培养方式等，以求两种菌之间最大的兼容性。但至少在本次试验中，我们见证了构建共培养体系的优势。

4 结论

4.1 比较T43、T101、ZT05、T14、5436这5株木霉菌株，ZT05是与促生细菌ZB155具有最佳兼容性的，可用于构建共培养体系。

4.2 在离体互作中，木霉ZT05与促生细菌ZB155之间并没有展现出明显的抑制作用，尤其是在生防作用方面。

4.3 木霉ZT05与促生细菌ZB155的共培养体系在对立枯丝核菌的拮抗作用研究中展现出了较好的作用，相比于单独培养，共培养体系的拮抗作用有明显的增强，尤其在发酵液的对峙中，促进作用明显。这证明了多种菌株共培养体系的建立是有利的。

4.4 本次离体共培养体系的建立展现了其优越性及潜力，在生防作用上，为以后的接种试验打下基础。

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