丁 霞，霍新慧，昂沙尔·毕哈孜

(新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种目前仍然原因不明的慢性自身免疫疾病，其特征是关节滑膜炎症[1]，通常会导致关节破坏并使患者的生活质量显著下降，现在仍然没有能完全治愈的方法[2]。西医药物治疗虽效果显著，但副作用大，患者经济负担重；中医外治法疗效显著，治疗费用较合适，在治疗RA方面有很大的科学研究价值和临床应用前景[3]。自噬(autophagy)被认为是一种重要的细胞内机制，研究发现，自噬在各种自身免疫性疾病(包括RA)中失调，并与多种免疫和非免疫细胞的成熟存活和增殖有关，在RA发病机理中起着关键作用[4]。目前针刺和艾灸对于细胞自噬干预RA的报道较少，但自噬蛋白表达与RA的关联可能对本病的发病机制发挥着重要作用，故本研究分别以艾灸和针刺干预RA大鼠，比较两种手段对RA的作用差别，并观察二者对大鼠滑膜组织自噬相关蛋白的影响，从而探讨RA的发病机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

1.1.1 试剂 完全弗氏佐剂(美国Sigma公司，美国，批号：SLBW7430)；甲氨蝶呤片(规格2.5 mg/片，购于上海医药有限公司信谊制药厂，批号：161003)；特制香烟型纯艾条(规格4 mm×120 mm，南阳卧龙汉医艾绒厂)；悬灸支架(蕲春上工记艾灸器具开发有限公司);华佗牌一次性不锈钢针灸针(规格0.3 mm×13 mm苏州华佗医疗器械有限公司)；LC3-Ⅱ试剂盒(英国Abcam公司，批号：GR3201455-1)；Beclin-1试剂盒(英国Abcam公司，批号：GR3204186-1)；内参GAPPH(英国Abcam公司，批号:GR3249122-1)。

1.1.2 仪器 多功能酶标仪(瑞士TECAN公司，型号：Infinite M200 Pro)；通用型电泳仪(美国BIO-RAD Serial公司，型号：042BR11250)；电泳槽(美国BIO-RAD Serial公司，型号：552BR071035)；转印槽(美国BIO-RAD Serial公司，型号：49BR36704)；微型离心机(美国六一仪器厂，型号：WD-2105A)。

1.2 实验动物

Wistar 健康大鼠50只，清洁级，雌雄各半，体质量160～200 g，购置并饲养于新疆医科大学动物实验中心。实验动物质量合格证许可证编号:SYXK(新)2016-0002。将大鼠饲养于温度(22±2)℃、湿度55 %～60 %的标准居住环境，自由摄食及饮水，12 h光照。屏障环境质量合格证65000700000749。

1.3 造模方法

建立佐剂型关节炎大鼠(Adjuvant arthritis，AA)模型，各组大鼠左足趾底部皮肤常规消毒后注射完全弗氏佐剂(0.1 mL/只)进行造模，造模3 d后根据课题组前期经验[5]利用关节炎指数(Arthritis index，AI)进行评分。模型成功判定标准：关节正常为0分；足小趾关节肿胀为1分；趾关节、足趾均肿胀为2分；踝关节以下肿胀为3分；踝关节在内全部足爪肿胀为4分。每只大鼠四肢评分分数相加值即为AI值，分数超过6分即造模成功。

1.4 分组方法

50只健康大鼠适应性饲养3 d后，对大鼠进行称重、标号，选取10只为正常组(随机数字表法)，将剩余40只造模成功的大鼠随机分为造模组、阳性对照组、针刺组和艾灸组(随机数字表法)，每组10只。

1.5 干预方案

1.5.1 正常组和造模组 两组大鼠均不进行任何干预。

1.5.2 阳性对照组 大鼠按照0.1 mg/100 g的剂量进行甲氨蝶呤灌胃，1次/3 d(每周2次)，共21 d。

1.5.3 艾灸组 用自制鼠架将大鼠摆好姿势，用自行改良的悬灸支架固定温灸纯艾条(规格4 mm×120 mm)，选取双侧足三里、肾俞(按照《实验针灸学》动物穴位图谱[6])艾条温和悬灸治疗，两个腧穴同时进行，每穴20 min，左右侧腧穴交替进行。1次/d(均上午9:00开始)，每次20 min，连续干预6 d后休息1 d,共21 d。

1.5.4 针刺组 大鼠固定、选穴和治疗时间同艾灸组，操作者左手爪切按压所刺部位，右手持针，以拇、食、中三指挟持针柄，快速进针，每天由同一人对大鼠进行针刺，每间隔5 min进行提插捻转。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 AI指数测定 各组大鼠按照1.3操作方法于造模成功和治疗结束后进行AI指数评分。

1.6.2 足爪容积测定 采用排水法原理和AI指数同一时间点测量足爪容积，具体测定方法如下：标记AA大鼠踝关节高点之上1 cm处，用装满水的10 mL玻璃刻度管，由专人将大鼠足部垂直插入水中至记号后取出，再用灌满水的5 mL注射器往刻度管中加水至原有高度之后观测注射器中剩余水量，加入刻度管中的水量即为足爪容积，每只足爪测量两次取平均值。

1.6.3 血清指标测定 大鼠治疗21 d后统一处理，将各组大鼠予10 %水合氯醛腹腔麻醉后，腹主动脉采血做相应记号，并放置于室内1 h，4 ℃离心(3 000 r/min)5 min，取上清液放入EP管内-20 ℃保存。按照ELISA试剂盒试说明书逐步检测大鼠血清TNF-α、IL-1β水平。

1.6.4 自噬指标测定 剥离滑膜组织后，放入4 %多聚甲醛固定液中保存。滑膜组织常规病理切片，脱蜡至水，按照Western Blot检测大鼠滑膜组织LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达量，内参为GAPDH。取大鼠滑膜组织用冰研磨，然后离心分离取上清，蛋白量的测定使用相应的BCA 蛋白质试剂盒；依次加样、凝胶电泳、转膜和室温封闭；按抗体说明书加入一抗LC3-Ⅱ(1∶3 000)、Beclin-1(1∶3 000)、置4 ℃冰箱过夜，洗膜，再加入二抗(1∶10 000)，ECl显色;放于凝胶图像成像分析系统，曝光其蛋白条带。

2 结果

2.1 AI指数和足爪容积比较

4组大鼠造模后与正常组比较，其AI指数和足爪容积指标均明显上升，差异具有统计学意义(P<0.01)；与造模组比较，大鼠经治疗后，其AI指数和足爪容积指标均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05或0.01)。见表1。

表1 各组大鼠AI指数和足爪容积比较

2.2 血清TNF-α、IL-1β水平比较

与正常组比较，造模组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显上升，差异具有统计学意义(P<0.05)。与造模组比较，阳性对照组、针刺组和艾灸组TNF-α、IL-1β水平均显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清TNF-α、IL-1β比较

2.3 滑膜组织LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达比较

与正常组比较，造模组LC3-Ⅱ蛋白表达上升，差异具有统计学意义(P<0.05),Beclin-1蛋白表达明显上升，差异具有统计学意义(P<0.01)，阳性对照组和针刺组Beclin-1蛋白表达上升显著，差异具有统计学意义(P<0.01)；与造模组比较，针刺组LC3-Ⅱ蛋白表达明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01),Beclin-1蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，艾灸组LC3-Ⅱ蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，Beclin-1蛋白表达显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3、图1。

表3 各组大鼠滑膜组织LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达比较

3 讨论

现代医学认为类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、炎症性自身免疫性疾病，病因和发病机制目前仍然不明确，病情会导致进行性关节破坏甚至畸形，更严重者可导致关节糜烂和全身器官受累[7]。由于RA无法治愈，其治疗目标是减少关节炎症和疼痛，最大限度地发挥关节功能。传统的西药虽见效快但毒副反应明显,易产生依赖性且停药后易反弹；新兴的生物制剂虽能避免传统药物的某些弊端，但药价昂贵[8-9]。由此可见现代医学治疗 RA 虽然效果明显，但是仍有不足。

RA属于中医“痹证”范畴，《济生方·痹》云：“非独责之于风寒湿，体虚相合，痹证乃生。”[10]指出 RA 的发生与内、外二因均有关系。RA是由机体正气内虚，加之感受风、寒、湿等邪气，壅塞经脉，深入骨节所致。初期治疗应以驱邪通络、缓急止痛为主，后期则以扶助正气为主。足三里作为胃经的合穴、回阳九针穴之一，能兼顾RA初期和后期病机，将补益气血、顾护正气贯穿于治疗始终[11]。《灵枢·四时气》篇曰：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里”，可见足三里穴在治疗痹证中的重要地位[12]。肾俞属足太阳膀胱经，为肾的背俞穴，乃肾脏之气输注、聚结于体表之部位，具有补虚培元之功，对脏腑、经络和气血津液的失调都有很好的调整作用[13]。且肾在体合骨，RA 的典型症状就是骨骼关节的疼痛、变形。足三里、肾俞二穴，兼顾先天、后天，二穴相配伍，能以后天补先天，先天生后天，可以起到补益正气、舒缓筋脉的整体调节作用，又能疏通局部经络、活血温通以止痛。

目前针灸在治疗RA方面有独特的疗效和优势，在提高患者的生活质量、改善RA的预后等方面有着重要作用[9]。针刺穴位治疗RA疗效显著[14],有祛风散寒、通痹止痛的功效，广泛的临床和实验动物研究表明：艾灸疗法应用治疗关节炎具有良好的疗效，能减轻症状，控制病情，恢复关节功能，被越来越多的患者所接受，有很好的应用前景[15-16]。

自噬最初被认为是一种细胞内务处理途径，通过调节分解代谢过程和清除病原体表现出细胞保护作用[17]。自噬启动的主要信号线索集中在PI3K调节上[18]。自噬的早期启动步骤由不同的信号感应蛋白调节，包括4种蛋白激酶:哺乳动物雷帕霉素靶复合物1 (mTORC1)、ULK1、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和AKT[19-20]。微管相关蛋白轻链-3 ( microtubule-as-sociated protein,Light chain-3,LC3)，被称为酵母细胞中自噬相关基因Atg8的类似物，是自噬体的特异性标记蛋白[21]，LC3-Ⅱ复合物是评估自噬水平的关键指标[22]。Beclin蛋白复合物-1( Beclin-1)是哺乳动物参与自噬的特异性基因，在自噬体的形成过程中至关重要，是酵母ATG6的同系物，是PI3K复合物的组成部分[23]。LC3-Ⅱ复合物、Beclin-1均是有关自噬相关蛋白研究的主要主题之一[24]。

现已有研究发现自噬也是自身免疫疾病发病机理之一，自噬可能参与了类风湿关节炎的发病机制，自噬已成为RA发病机制的媒介[25]。TNF-α和IL-1β是最重要的促炎细胞因子，它们具有强大的促炎活性，并且可以促进各种促炎介质的分泌，在类风湿关节炎滑膜内表达[26]，并能诱导类风湿关节炎滑膜成纤维细胞，使蛋白酶和促炎细胞因子增殖和产生黏附分子[27]。自噬与促炎细胞因子密切相关、相互影响，炎症的激活触发自噬体的形成，并且自噬水平的上调以自噬形成标记物LC3-Ⅱ和Beclin-1的显著增加为标志[28]。

本实验发现造模组相比正常组滑膜组织病理损害严重，大量的炎细胞浸润、自噬相关蛋白表达上升。通过治疗，阳性对照组、针刺组与艾灸组的滑膜组织病理改变都有明显减轻，血清中的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β均有所下降；各组的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达均有所降低，其中针刺组LC3-Ⅱ蛋白表达和艾灸组Beclin-1蛋白表达下降最明显，提示无论是针刺还是艾灸对RA均有治疗效果，其治疗RA的机制可能与抑制自噬蛋白表达相关，自噬可能是RA的发病机制之一，但具体的机制仍有待进一步研究。