于 莉，张 敏，张小华，李丽华（儋州市人民医院检验科，海南儋州 571799）

脓毒症是由感染、创伤、手术等引起的全身炎症反应综合征，在老年人中有着极高的发病率和死亡率，是目前世界范围内威胁人类健康的主要疾病之一[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为一类长度为18～24bp的非编码RNA分子，参与组织炎症损伤等病理过程，在脓毒症的发生发展及预后判断中发挥着重要的作用[2-3]。近年来有研究指出，miR-206及miR-451通过多种方式调节免疫应答，对脓毒症的发生发展有重要影响，有望为脓毒症的治疗提供新方向[4-5]。然而，目前还没有老年脓毒症决定性的诊断或预后生物标志物。为此，本研究通过检测老年脓毒症患者第1，3和7天血清miR-206及miR-451表达水平变化，分析其对老年脓毒症患者严重程度及预后判断的价值，为了解miR-206及miR-45是否可能是老年脓毒症的有用生物标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月～2020年12月儋州市人民医院收治的158例老年脓毒症患者，其中男性93例，女性65例，年龄60～82（70.83±9.52）岁。根据国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南[6]，将158例脓毒症患者分为脓毒症非休克组（n=94）和脓毒症休克组（n=64）。以158例脓毒症患者住院当天为研究起始点，根据患者28天的生存情况，将其分为存活组（n=115）和死亡组（n=43）。死亡时间为15.30±10.20天，死亡原因为休克、多器官功能衰竭、肾衰竭、心力衰竭及呼吸衰竭。纳入标准：①符合国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南；②住院时间≥7天。排除标准：①并发血液系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤者；②不能配合研究者。脓毒症非休克组和脓毒症休克组的性别、年龄及基础疾病等一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 7300型荧光定量PCR仪（美国ABI公司），PCR试剂盒、RNeasy试剂盒、miRNA Easy试剂盒和Trizol试剂盒均购自北京奥科生物有限公司。

1.3 方法 所有患者于住院第1，3和7天采集静脉血3 ml离心分离血清，使用ABI 7300型荧光定量PCR仪进行实时荧光定量聚合酶链反应(RTPCR)。以U6为实验内参，PCR总反应体系为20 μl：1μl 引物及探针Mix（20×），10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl反转录产物cDNA，7.67μl双蒸水；反应条件：95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸60s，进行45个循环。采用2-△△Ct法计算结果。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。应用受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-206及miR-451预测老年脓毒症患者死亡的价值。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脓毒症休克组和脓毒症非休克组血清miR-206及miR-451表达水平比较 见表1。脓毒症休克组第1，3，7天血清miR-206及miR-451表达水平均明显高于脓毒症非休克组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。

表1 脓毒症休克组和非休克组血清miR-206及miR-451表达水平比较（±s）

表1 脓毒症休克组和非休克组血清miR-206及miR-451表达水平比较（±s）

项目 脓毒症非休克组（n=94） 脓毒症休克组（n=64） t P miR-206 第1天 2.62±1.05 4.28±1.60 13.512 ＜0.01第3天 3.15±1.40 5.63±2.19 16.715 ＜0.01第7天 2.96±1.27 6.05±2.58 19.630 ＜0.01 miR-451 第1天 1.93±0.86 3.08±1.42 10.417 ＜0.01第3天 2.46±1.02 4.27±1.53 14.615 ＜0.01第7天 2.30±0.95 4.93±1.80 16.804 ＜0.01

2.2 脓毒症死亡组和脓毒症存活组血清miR-206及miR-451表达水平比较 见表2。死亡组第1，3，7天血清miR-206及miR-451表达水平均明显高于存活组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。

表2 脓毒症死亡组和存活组血清miR-206及miR-451表达水平比较（±s）

表2 脓毒症死亡组和存活组血清miR-206及miR-451表达水平比较（±s）

项目 存活组（n=115） 死亡组（n=43） t P miR-206 第1天 2.50±0.97 4.45±1.66 14.730 ＜0.01第3天 2.90±1.35 6.12±2.64 20.153 ＜0.01第7天 2.83±1.31 6.37±2.71 22.814 ＜0.01 miR-451 第1天 1.80±0.81 3.35±1.48 12.506 ＜0.01第3天 2.17±0.92 4.70±1.72 16.375 ＜0.01第7天 2.05±0.86 5.37±1.80 20.748 ＜0.01

2.3 miR-206及miR-451预测老年脓毒症患者死亡的价值 见表3和图1，图2，图3。在单项指标中，第3天miR-206最佳截值取4.52时，其预测老年脓毒症患者死亡的敏感度和特异度较好，分别为82.7%和88.0%。第3天miR-206及miR-451两项联合预测老年脓毒症患者死亡的曲线下面积（0.936，95%CI ：0.877～0.994）明显高于单项miR-206（0.853，95% CI ：0.794～0.915）及miR-451（0.828，95%CI ：0.770～0.884），差异均有统计学意义（P＜0.05），其敏感度和特异度为97.2%和86.0%。

图3 miR-206及miR-451两项联合预测老年脓毒症患者死亡的ROC曲线

表3 miR-206及miR-451预测老年脓毒症患者死亡的价值 （%）

图1 血清miR-206表达水平预测老年脓毒症患者死亡的ROC曲线

3 讨论

脓毒症是一种免疫反应失调的危重症，影响全球人类生命健康。miRNA是一类基因表达的重要调控因子，参与调控细胞增生、凋亡、免疫炎性反应等多种机体生物学过程，在脓毒症相关性炎症反应以及器官损伤过程中发挥重要的调控作用[7-8]。LI等[9]研究证实，miRNA表达水平的变化与脓毒症病程发展密切相关，监测分析miRNA水平有助于辅助诊断脓毒症，判断疾病预后，有望作为脓毒症治疗的潜在靶点。ROGOBETE等[10]研究认为，miRNA是一类内源性非编码RNA，通过调控炎症信号通路中关键分子的表达，参与调控脓毒症的炎症反应及免疫抑制，在脓毒症诊断和预后评估中具有较大的潜力。

本研究脓毒症休克组第1，3，7天血清miR-206及miR-451表达水平均明显高于脓毒症非休克组；死亡组第1，3，7天血清miR-206及miR-451表达水平均明显高于存活组。说明血清miR-206及miR-451表达水平在脓毒症休克患者早期即可明显升高，其水平变化可在一定程度上反映脓毒症患者的病情严重程度，死亡患者引起的炎症反应无法得到有效地控制，血清miR-206及miR-451表达水平显著升高。提示miR-206及miR-451高表达的患者，病情较为严重，临床上应及时采取有效的治疗措施。GUI等[11]研究显示，随着脓毒症患者病情加重，miRNA表达水平逐渐升高，提示miRNA表达与脓毒症患者病情严重程度相关，是反映脓毒症患者病情严重程度的新型指标。SZILÁGYI等[12]研究表明，miRNA的异常表达与脓毒症的临床特征和预后相关，可以作为脓毒症潜在的诊断和预后的生物标志物，为脓毒症基因水平治疗提供新的思路。

本研究ROC曲线显示，不同时间点血清miR-206及miR-451表达水平预测老年脓毒症患者死亡的曲线下面积不同，第3天miR-206及miR-451两项联合预测老年脓毒症患者死亡的曲线下面积最大，对预测老年脓毒症患者死亡的价值较高。LIANG等[13]研究指出，与健康人相比，脓毒症患者miR-206显著上调，血清miR-206的表达与脓毒症的严重程度及预后呈正相关，可能是评估脓毒症严重程度和预后的潜在生物标志物。WANG等[14]研究发现，血清miR-451a升高与脓毒症严重程度和炎症反应相关，可作为脓毒症的诊断生物标志物和判断疾病严重程度的潜在指标。另有研究认为，miRNA表达水平升高与脓毒症患者病情严重和预后不良相关，可以作为评估脓毒症患者病情严重程度和预后的一个有用的生物学指标[15]。

综上所述，血清miR-206及miR-451表达水平在老年脓毒症患者中明显升高，其高表达与老年脓毒症的病情严重程度及预后相关，动态监测第3天血清miR-206及miR-451表达水平对预测老年脓毒症患者死亡具有较好的价值。