章 昱，谭 强，曾春晖，谢文佩*

（广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530222）

酵素是以药食两用药材或水果蔬菜等为原料，在一定条件下经过发酵制成的具有营养和保健功能可食用性产品[1-2]。铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年生附生草本植物，作为药食两用的名贵药材，具有较高的药用价值和研究意义，现代药理研究表明[3]，铁皮石斛具有抗提高人体免疫力、降血脂血压等功效，对于肿瘤、凝血障碍等疾病也有一定的效果，还能控制血糖、延缓衰老等，属于中药珍稀资源。野生铁皮石斛较为稀缺，生长环境要求严苛，目前通过人工栽培种植，能够使产量提高但品质也在下降[4]，在现有的资源基础上需要采取更多合理的提高利用率的手段。市面上主要以茎为药用部位，叶作为非药用部位，相对利用率较低。目前有对于铁皮石斛药用部位制备酵素的研究，包括其制备工艺及活性成分研究等[5-7]，但对其叶制备酵素的研究较少，铁皮石斛叶作为副产物，采摘中占铁皮石斛总生物量的一半左右[8]，含有丰富的多糖、黄酮等活性物质[9]，并具有一定的抗氧化能力[10]，随着社会需求的增多，关于铁皮石斛副产品资源逐渐被重视起来。唐靖雯等[11]进行铁皮石斛叶月饼、面条、曲奇、蛋糕和饼干等研究；夏雨等[12]以苦荞和铁皮石斛叶为主要原料，优化苦荞石斛叶发酵酒的生产工艺；杜冰等[13-14]制备铁皮石斛叶发酵调味酱和铁皮石斛叶发酵酒。

铁皮石斛作为我国特有的中药材资源，在种植栽培、成品加工、活性成分提取应用及研究等领域拥有众多的研究，在生物发酵加工方面以工艺优化为主，取最佳工艺进行检测证明其有一定的抗氧化性，但对于其加工过程的动态变化研究较少，本研究旨在有效保护和利用珍贵的药食两用资源，提高铁皮石斛的附加值，研究其叶子在发酵过程中活性物质含量及抗氧化能力的变化并进行分析，为提高铁皮石斛叶酵素的可控性以及相关产品的研究开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛叶：广西金草农业科技有限公司。

安琪酵母酸奶发酵剂（8菌型）：安琪酵母旗舰店；白砂糖：市售；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、PBS缓冲液、福林酚、没食子酸、2,2-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）：北京索莱宝科技有限公司；盐酸（分析纯）：廉江市爱廉化试剂有限公司；乙酸锌、过硫酸钾、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、水杨酸钠（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；三氯化铁、无水碳酸钠（均为分析纯）：天津奥普升化工有限公司；体积分数95%乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；铁氰化钾（分析纯）：天津市永兴化学试剂厂；磷酸氢二钠（二水）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸、苯酚（均为分析纯）：广东光华科技股份有限公司；30%过氧化氢（分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；邻苯三酚（分析纯）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 仪器与设备

LRH-250生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；759s紫外可见分光光度计：INESA上海仪电分析仪器有限公司；TD-5台式低速离心机：四川蜀科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛叶酵素样品加工工艺流程及操作要点

铁皮石斛叶的择选→称质量→破碎打浆→煮沸加糖→冷却接种→恒温发酵→发酵产物离心取上清液→装瓶→酵素成品

原料预处理：挑选新鲜、无腐烂虫害的铁皮石斛叶，备用。

称质量、破碎打浆：称取铁皮石斛叶50 g，加入150 g的水，放入破壁机打碎成浆。

煮沸：将打好的浆液煮沸至起泡，加入30 g白砂糖。

接种、密封：将冷却好的浆液于超净台接入菌种1 g，摇晃均匀，密封。

发酵：将接种后的浆液放在恒温培养箱42 ℃恒温发酵50 d。

离心过滤：将酵素置于台式低速离心机中4 000 r/min离心15 min，过滤后取滤液。

1.3.3 分析检测

（1）多糖含量的测定

参考郑柏勤等[15]的比色法测铁皮石斛中的多糖：建立葡萄糖标准曲线，根据测定的吸光度值在标准曲线上查得样品溶液的糖含量，并根据稀释倍数计算酵素中的多糖含量。

（2）总黄酮含量的测定

按照GB/T 20574—2006《蜂胶中总黄酮含量的测定方法》分光光度比色法[16]测定。

（3）多酚含量的测定

按照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定》分光光度法[17]测定。

（4）超氧化物歧化酶活性的测定

按照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的测定》[18]测定。

（5）羟自由基清除率的测定

采用Fenton法[19]，向1.4 mL 6 mmol/L的H2O2中加入335 μL酵素样品，再加入0.6 mL 20 mmol/L的水杨酸钠和2 mL 1.5 mmol/L的FeSO4，37 ℃恒温水浴1 h。以纯净水为参比溶液，在波长562 nm处测定吸光度值，按照以下公式计算羟自由基清除能力：

式中：A0为空白对照液的吸光度值；A1为样品测定管的吸光度值；A2为样品空白管的吸光度值。

（6）还原力的测定

采用铁氰化钾法[20]，向2.5 mL H3PO4缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）加入30 μL酵素样品，然后加入2.5 mL 10 g/L铁氰化钾，50 ℃水浴反应30 min，再加入100 g/L三氯乙酸2.5 mL，静置后取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 1 g/L FeCl3。以纯净水为参比溶液，于波长700 nm处测定吸光度值。

（7）DPPH自由基清除能力的测定

参考樊秋元等[21]DPPH自由基清除实验方法进行测定。

（8）ABTS自由基清除能力的测定

采用ABTS过硫酸钾显色法[22]，用7 mmol/L的ABTS（用5 mmol/L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）配制，pH 7.4），加入过硫酸钾，最终浓度为2.45 mmol/L，室温下黑暗放置16 h。使用前用PBS溶液将ABTS溶液稀释至吸光度值为A=0.7±0.02（734 nm）。取10 μL样品加入5 mL上述稀释液中，在30 ℃条件下反应5 min。以去离子水为参比溶液，在波长734 nm处测定吸光度值，按照以下公式计算ABTS自由基清除力：

式中：A0为空白对照液的吸光度值；A1为样品测定管的吸光度值；A2为样品空白管的吸光度值。

（9）理化指标检测

pH、乙醇、氯化钠的测定按照中国生物发酵产业协会团体标准T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》进行检测。

1.3.4 数据处理

采用Origin 9.5软件制表格及作图，IBM SPSS Statistics 19.0软件进行相关性分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛叶酵素发酵过程中多糖含量变化

由图1可知，0～10 d时铁皮石斛叶酵素中的多糖含量呈上升趋势，于第10天达到最高值0.45 g/mL，在发酵中，物质传递效率较高，有利于多糖的溶出[23]，随着后期发酵的进行，微生物不断生长，消耗糖分，20～30 d变化较为平缓，30～45 d下降幅度较大，在发酵进行到45～50 d时，多糖含量已低于0.25 g/mL。随着发酵时间的变化，多糖不断进入到整个发酵液内，同时多糖作为微生物进行增殖和合成代谢的重要来源[24]，被不断的消耗，可以发现多糖含量的降低与溶出的减少及微生物的生长利用有关。

图1 酵素发酵过程中多糖含量的变化Fig. 1 Changes of polysaccharides contents of Jiaosu during fermentation process

2.2 铁皮石斛叶酵素发酵过程中黄酮含量变化

由图2可知，随着发酵时间的延长，黄酮含量在0～15 d呈上升趋势，在第15天达到最大值0.14%，15～50 d逐渐平稳下降。可能由于微生物的转化使黄酮含量增加，15 d后随着发酵的进行，黄酮含量也在不断下降，一部分原因可能是部分黄酮类化合物转化为小分子酚类物质，也可能由于发酵菌株对黄酮有一定的分解能力，以及黄酮的不稳定性，使得发酵后期黄酮含量不断下降。

图2 酵素发酵过程中总黄酮含量的变化Fig. 2 Changes of total flavone contents of Jiaosu during fermentation process

2.3 铁皮石斛叶酵素发酵过程中多酚含量变化

由图3可知，随着发酵时间的延长，多酚含量总体呈先升后降趋势，于第25天达到最高值18.43 mg/L，发酵前期多酚含量上升较快，可能是微生物对植物原料的破壁作用，酚类物质能快速溶出。25 d后可能因发酵菌群等物质的生长繁殖、代谢过程中产生的酶等对多酚等大分子物质进行分解，导致多酚的含量降低，有研究表明，可能存在部分生存能力强的微生物，在适应总酚浓度较高的发酵液后，利用酚类物质合成其他次级代谢产物[25]，从而导致多酚类物质含量下降。

图3 酵素发酵过程中多酚含量的变化Fig. 3 Changes of polyphenol contents of Jiaosu during fermentation process

2.4 铁皮石斛叶酵素发酵过程中SOD活性变化

由图4可知，发酵开始时SOD 活性为最大值，达73.26 U/mL，50 d低至12.23 U/mL，整体呈下降趋势，说明酵素原料中本身SOD含量较高，但在发酵过程中，由于超氧化物歧化酶的不稳定性，或者是超氧化物歧化酶衰减的量高于产生的量，所以铁皮石斛叶酵素发酵时间越久其SOD活性低，清除超氧阴离子自由基的能力也逐渐变弱。

图4 酵素发酵过程中超氧化物歧化酶活力的变化Fig. 4 Changes of SOD activity of Jiaosu during fermentation process

2.5 酵素发酵过程中羟自由基清除率的变化

由图5可知，铁皮石斛叶本身具有一定的清除羟自由基能力，随着发酵时间的延长，羟自由基清除率呈先平缓后下降趋势，且前期发酵对于其能力影响不大，25 d后大幅度下降，35 d后检测为负值，呈现促氧化现象。分析可得羟自由基清除率与多糖、黄酮及多酚均呈正相关，有研究表明铁皮石斛多糖有清除羟自由基能力[26]，在发酵后期随着多糖等活性成分的不断降低，羟自由基清除能力下降，同时，黄酮类物质的分子结构变化也会检测到促氧化现象，黄酮类化合物的促氧化性质之一是对还原性巯基的消耗，B环上羟基的数量越多，消耗巯基的能力越强[27]，推测负值的出现很可能与总体活性物质的降低、微生物的衰亡[24]及黄酮类化合物结构的变化有关。

图5 酵素发酵过程中羟自由基清除能力的变化Fig. 5 Changes of scavenging ability of hydroxyl radical of Jiaosu during fermentation process

2.6 酵素发酵过程中还原力的变化

由图6可知，本研究利用铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）进行评价，发酵液随着发酵时间的增加，还原力整体上呈先上升后下降的趋势，40 d达最高值0.299。可得知酵素的还原力随着发酵时间增加而增强，到达一定值后便开始变弱，有研究表明还原能力的增加与细胞内的抗氧化剂、起始生物肽及其供氢能力也有一定联系[28]，故后期的下降与其他活性物质含量的下降有一定关系。

图6 酵素发酵过程中还原力的变化Fig. 6 Changes of reducing power of Jiaosu during fermentation process

2.7 酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化

发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化如图7所示。由图7可知，随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除率呈先下降后上升的趋势，30 d达最低值42.3%，30 d后开始上升，40 d后变化较为平稳且仍小于未发酵时的清除率，可以发现未发酵的铁皮石斛叶本身具有一定的清除DPPH自由基的能力，与黄酮和多酚的变化趋势并不一致。鄢贵龙等[29]发现其提取物的DPPH清除活性主要物质基础来源于总酚，而铁皮石斛叶酵素与其不同，由以上结果可以看出本酵素清除力不来源于其所含的多酚或黄酮，需要进行更深入的研究了解。

图7 酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化Fig. 7 Changes of scavenging ability of DPPH radical of Jiaosu during fermentation process

2.8 酵素发酵过程中ABTS自由基清除率的变化

由图8可知，随着发酵时间的延长，ABTS自由基清除率先下降，15 d达最低值0.55%，15 d后开始上升至20 d后趋于平缓，45 d后继续上升，50 d达最高值0.75%，与DPPH自由基清除力能力相关性不高，这说明即便DPPH与ABTS皆为抗氧化活力指标，但是不同的酚类物质起到的作用也不尽相同，这种差异性与原料、微生物菌种、发酵过程中的微生物所利用的原料成分以及发酵液代谢产物的不同有关[30-31]，因此对于抗氧化活力的评价需要综合分析。

图8 酵素发酵过程中ABTS自由基清除能力的变化Fig. 8 Changes of scavenging ability of ABTS radical of Jiaosu during fermentation process

2.9 一般理化指标检测

按照中国生物发酵产业协会团体标准T/CBFIA08003—2017《食用植物酵素》对本研究所述酵素进行检测，检测结果见表1。由表1可知，各指标均符合标准。

表1 铁皮石斛叶酵素基本理化指标检测结果Table 1 Detection results of basic physical and chemical indexes of Dendrobium candidum leaves Jiaosu

2.10 相关性分析

由表2可知，多糖含量与总黄酮、SOD、羟自由基清除率、ABTS自由基清除率显著相关且为正相关（P＜0.01），与还原力呈负相关，可能由于微生物发酵过程中，利用消耗糖类物质产生某些提高还原力的代谢产物。总黄酮含量与多酚含量呈极显著相关（P＜0.01）、与羟自由基清除率、ABTS自由基清除率显著相关（P＜0.05），与还原力和DPPH自由基清除率呈负相关；SOD与羟自由基清除率、ABTS自由基清除率呈极显著相关（P＜0.01），与还原力呈显著相关（P＜0.05），SOD本身具有较好的抗氧化力，随着含量的提高，整体抗氧化能力也得到提升；还原力与DPPH之间呈极显著相关（P＜0.01）。

表2 相关性分析矩阵Table 2 Correlation analysis matrix

2.11 各指标主成分分析

为了进一步了解各指标之间的相互关系，利用SPSS进行因子分析的降维处理，优化得到两个主成分。铁皮石斛叶酵素的第一主成分特征值贡献率为60.348%，第二主成分特征值贡献率为27.640%，两个主成分的累积贡献率为87.988%，与主成分分析的要求相符合，可以进行下一步分析。

表3 旋转成分矩阵Table 3 Rotational component matrix

表4 主成分的特征值、方差贡献率和累积方差贡献率Table 4 Eigenvalues,variance contribution rates and cumulative variance contribution rates of principal components

利用主成分分析法得不同发酵时间酵素的综合评价指标（comprehensive evaluation index，CEI），即以主成分对应的特征值除以该主成分特征值之和的比例得到综合评价指标。

如图9所示，发酵前10 d的CEI值明显升高，发酵10 d之后趋势逐渐下降并趋于平稳。参考CEI值的变化，结果表明，发酵至10 d，各种代谢指标为最佳状态，CEI值为0.93。随着发酵天数的增加，综合评价得分逐渐下降，因此，使用不同的单一或者综合指标对该产品功效进行评价的侧重点是不同的，不同需求所选择的发酵时间也不一样，微生物发酵是较为复杂的生理过程，应全面考虑酵素发酵过程中的变化，以得到更好的产品。

图9 铁皮石斛叶酵素发酵过程中综合评价指标的变化Fig. 9 Changes of comprehensive evaluation indexes during Dedrobium offcinale fermentation process

3 结论

本研究检测了发酵过程中活性物质和抗氧化力的变化，研究其动态变化规律并对其进行分析，为铁皮石斛叶酵素的开发利用提供理论依据。结果表明，铁皮石斛叶在发酵过程中：多糖、多酚、黄酮活性及清除还原力能力先上升后下降，SOD活性、羟自由基清除率呈下降趋势，DPPH自由基清除率呈先下降后上升趋势，而ABTS自由基清除率呈上升至平稳趋势，利用主成分分析和综合性评价对各指标进行综合分析，可以看出发酵10 d时综合得分最高。在发酵过程中，酵素活性物质和抗氧化能力的变化并不是呈现单一的递增规律，而是有增有减，酵素并非发酵越久越好，过长的发酵时间可能会使其被过度分解，活性和功效也随之下降，因此正确地认识发酵中各活性物质的变化过程，有助于提高发酵效率和成功率，但发酵过程变化非常复杂，作用机制也尚未明确，还需进一步研究。