游智湧 刘博林 刘程 高灯州

关键词：固氮过程;温度敏感性;同位素示踪;沉积物;长江口

0引言

河口近岸作为海陆交互的重要地带，是生物地球化学循环的“热区”.近几十年来，人类活动加剧导致河口及近岸地区的活性氮输入显著增加，进而引起富营养化和季节性缺氧等一系列环境问题.然而，除人为活性氮输入外，生物固氮也可能是河口海岸生态系统氮负荷增强的潜在因素.因此，开展河口及近岸地区生物固氮研究，对认识该区域氮素收支平衡及生态系统稳定具有重要意义.

目前，国内外学者对河口近岸水体或沉积物环境生物固氮过程已经开展了大量的研究，证实了其在河口生态系统氮素平衡中扮演着重要的作用[1-3].研究指出，河口近岸生物固氮过程具有显著的时空变异特征，其温度、盐度、pH值、氨氮、硝酸盐、硫化氢和铁等是影响固氮的主要环境因子.这些环境变量中，温度是影响固氮微生物代谢的最基本因素之一.有研究表明，温度可以通过改變固氮微生物的活性，进而影响固氮酶来调控氮循环过程[4-5].在缺铁的寡营养盐海域中，温度升高会缓解铁限制的束毛藻活性，有利于提高束毛藻的固氮速率，进而提高海洋生态系统的初级生产力[6].相反，在温度较低的情况下，微生物新陈代谢较慢，有机质矿化消耗的溶解氧较少，局部生成非厌氧区而抑制厌氧性固氮微生物的活性[7].尽管当前关于温度对微生物固氮过程的影响研究已有一些报道，但其效应仍未得到充分的认识.温度是衡量全球气候变化最为关键的参数之一，其对生态系统的稳定具有重要的意义[8-9].河口及近岸地区微生物氮转化过程是对温度变化较为敏感的区域，但其固氮过程对温度的响应还有待深入认识.因此，研究生物固氮过程的温度敏感性对评估全球气候变化背景下河口近岸地区生物氮输入及平衡具有重要的意义.

长江口是世界范围内的富营养化河口之一，受高强度人类活动的影响，每年都有大量的活性氮被输送到河口及其邻近的沿海地区[10-12].基于此，我们选取长江口沉积物为研究对象，探究沉积物中固氮过程的温度敏感性及影响因素.本研究有助于提高有关温度变化对河口及沿海生态系统氮循环过程影响机制的认识，以期为河口近岸生态系统氮素平衡及其对气候变化响应的模拟提供科学参考.

1研究区概况与研究方法

1.1 研究区域

长江口（120°30′E～124°30′E，30°00′N～30°30′N）是我国第一大河口，面积约8500km2.长江口属于典型亚热带海洋性季风气候，气候温和，四季分明.年温度变化范围为6.7～28.0℃，年平均温为16℃.多年平均降水量在1144mm，主要集中在4—9月份[13].每年从流域接收数亿吨悬沙和大量的污染物[14].此外，每年大量的无机氮（约1.1×106t）被排入长江口[15]，一定程度上加剧了水体富营养化、有害藻华爆发和大面积缺氧等生态环境问题[16].

1.2 样品的采集

选取长江口内4个采样点，分别为浏河口（LHK）、吴淞口（WSK）、白龙港（BLG）和崇明东滩（CMDT），两个口外采样点A1和A2（图1）.分别于2020年8月和9月，利用柱状采泥器采集每个站位点表层沉积物（0～5cm）和上覆水，并用便携式水质监测仪测定上覆水温度、pH值和盐度.采集的沉积物装入聚乙烯袋，放置于4℃保温箱并带回实验室.上覆水在实验室用0.22μm的滤膜过滤，用于温度梯度培养实验.沉积物样品分成两份，一份用于温度梯度培养的泥浆实验，分析固氮速率;另外一份用于理化性质测定.

1.3 理化性质的分析

采用邻菲罗啉比色法测定沉积物中的活性铁.具体地，用1mol·L–1的盐酸浸提，二价铁（Fe2+）直接加入显色剂显色分析，总铁（Fe）通过加入盐酸羟胺将三价铁（Fe3+）还原成Fe2+再进行分析[17]，Fe3+含量为总Fe和Fe2+的差值.沉积物中总有机碳（TOC），通过重铬酸钾-外加热法测定，具体是称取0.2g干土在170～180℃油浴中用0.8mol·L–1K2Cr2O7和浓硫酸各5mL消解5min.邻菲罗啉为指示剂，以0.2mol·L–1硫酸亚铁铵滴定过量的Cr5+，通过Fe2+的消耗量计算总有机碳[18].沉积物中氨氮（NH4+）和硝态氮（NO3–）利用2mol·L–1KCl浸提，并用连续流动元素分析仪（SANPlus，SkalarAnalyticalB.V.，theNetherlands）测定[19].沉积物中硫化物（S2–）先用1mol·L–1盐酸浸提，再利用醋酸锌吸收后基于亚甲基蓝分光光度法测定[20].

1.4 固氮速率的测定

基于沉积物泥浆培养，结合氮气同位素（15N2）示踪技术，测定潜在固氮速率.具体地，将沉积物和过滤的上覆水以质量比为1∶7比例混合均匀，并在充满氦气的手套箱中用氦气将泥浆曝气30min以去除背景氮气.随后，将泥浆转移到12mL顶空瓶中密封并原位温度预培养24h.预培养结束后，为使微生物适应设计温度（5、10、15、20、25、30℃），在相应的温度条件下再进行24h预培养.然后，取一半数量的顶空瓶注入0.2mL饱和的ZnCl2溶液作为起始样品.同时，另外一半数量的顶空瓶注射0.5mL15N2（99%15N;CamproScientific，Germany）作为终止样品，充分震荡之后分别在5、10、15、20、25、30℃条件下培养24h.培养结束后，将终止样品注入0.2mL50%饱和的ZnCl2溶液结束培养.整个培养过程产生的含15N产物用次溴酸盐碘溶液氧化后，利用膜进样质谱仪（MIMS）测定，并计算潜在固氮速率，公式为

式中：R表示固氮速率（nmol·g–1·h–1）;CInitial和CFinal分别表示起始和终止样品中15N标记的产物浓度（nmol·mL–1）;V表示培养泥浆的体积（mL）;W表示沉积物的干重（g）;T表示培养时间（h）.

1.5 数据分析

利用SPSS23.0进行数据统计分析，利用单因素方差（One-wayANOVA）分析不同培养温度下固氮过程的差异性，采用LSD（leastsignificantdifferencetest）进行显著性检验，采用Peason相关分析揭示沉积物理化性质与固氮速率的相关性.用Origin2021制图.

2结果与分析

2.1 沉积物的理化性质

各采样点沉积物理化性质如表1所示.采样期间（8月份或9月份），长江口沉积物温度范围为20.5～30.8℃.沉积物盐度和pH值分别介于0.15～31.68和7.62～8.40，其中长江口内（LHK、WSK、BLG、CMDT）沉积物盐度和pH值均显著低于长江口外（A1和A2）.长江口内沉积物硫化物浓度（0.08～1.22μmol·g–1）显著低于长江口外沉积（3.31～6.48μmol·g–1），且在A2站点具有最高值.沉积物Fe2+和Fe3+浓度分别为1.51～3.10mg·g–1和0.88～1.35mg·g–1，其中，Fe2+浓度在LHK最高，而Fe3+浓度在CMDT最高.沉积物NH4+和NO3–浓度范围分别为3.35～188.96μg·g–1和1.73～24.81μg·g–1，其中，WSK的NH4+浓度最高，而CMDT的NO3–浓度最高.沉积物TOC浓度范围为6.70～11.59mg·g–1，其中，A2样点TOC含量最高，而CMDT最低.

2.2 不同温度对固氮过程速率的影响

各站点原位固氮速率范围为0.72～2.85nmol·g–1·h–1，具有显著的空间变异性，LHK和A2站点固氮速率最高，而BLG固氮速率最低（表1）.不同培养温度条件下各采样点潜在固氮速率如图2所示.在5、10、15、20、25、30℃培养条件下，沉积物固氮速率介于0.07～3.38nmol·g–1·h–1.LHK、WSK、BLG、CMDT、A1和A2固氮速率的均值分别为（1.07±0.28）、（1.92±0.88）、（0.83±0.29）、（0.94±0.43）、（1.11±0.29）和（1.35±0.95）nmol·g–1·h–1，其中，WSK样点的平均固氮速率最大为（1.92±0.88）nmol·g–1·h–1，而样点BLG的平均固氮速率最小为（0.83±0.29）nmol·g–1·h–1.

不同温度培养下，沉积物固氮速率有所不同（图2）.除CMDT外，各站位在20℃条件下具有最高固氮速率，而在10℃条件下具有最低固氮速率（除A2外）.总体而言，各采样点沉积物潜在固氮过程速率对温度变化的响应相似（图2）.具体看，5℃条件培养下的固氮速率均显著高于10℃条件下的固氮速率.而后，随着温度的升高，固氮速率呈显著的上升趋势，并在20℃左右达到最高值.而当温度高于20℃时，随温度升高，固氮速率总体呈显著下降趋势.虽然各站点沉积物理化性质差异较大，但其固氮过程速率对温度变化的响应总体是一致的.

2.3 沉积物固氮速率与理化性质的相关关系

如表2，在5℃条件下培养时，沉积物固氮速率与硫化物的含量呈显著正相关关系（p<0.05）.当温度上升到10℃时，沉积物固氮速率与硫化物含量仍呈显著的正相关关系，但与硝酸盐的含量呈显著的负相关关系（p<0.05）.當温度达到15℃甚至更高时，温度与理化参数无明显的相关性.随着温度的升高，固氮速率与沉积物中氨氮和Fe3+的相关程度逐渐增加，但与TOC浓度和硫化物含量的相关关系则逐渐降低.除此之外，不同温度条件下，沉积物的固氮速率与盐度、pH值、Fe2+均无显著相关关系.

3讨论

3.1 长江口沉积物固氮过程的温度敏感性

河口沉积物生物固氮过程在调节该生态系统初级生产力中具有重要的作用，但也可能是氮负荷增强的主要途径[21].固氮过程是将大气中的氮气转化成氨或者其他分子的过程，在这个过程中，温度作为基础影响参数扮演着非常重要的角色[22].本文研究发现，除CMTD样点外，固氮速率随温度的升高总体表现为先降低（5到10℃），然后升高（10到20℃），再降低（20到30℃）的变化特征（图2）.许多研究表明，硫酸盐还原菌参与沉积物的固氮过程，Narrangaset沉积物中的nifH基因是从硫酸盐还原菌中获取的[8，23-24];而Brauer等[4]指出，短时间培养的硫酸盐还原菌最适温度为2～9℃.在低于10℃温度条件下，随着温度增加，沉积物中硫酸盐还原菌会加速硫酸盐异化还原成硫化物，导致沉积物中硫化物大量堆积，在一定程度上会抑制固氮微生物的活性，进而降低固氮速率[25].当温度介于10～20℃时，温度增加对沉积物固氮过程具有显著的促进作用.Wang等[17]指出，温度和有机质是影响湿地沉积物固氮速率的主要环境因子.温度升高可以加速有机质的分解进而降低氧气可利用性含量，为固氮过程提供厌氧环境、电子受体和足够的能量.前人研究报道指出，固氮菌最适温度范围介于15～20℃[26]，且温度变化能够影响固氮菌的菌群结构和酶的活性[22].温度增加能够促进沉积物中铁的矿化，细胞会提高吸收固氮酶合成所需要铁元素的效率，合成更多的固氮酶[6].在河口偏碱性环境中，活性铁大多以二价铁的形式存在，可与沉积物中硫化物结合形成FeS或者FeS2，进而降低沉积物硫化物的生物毒性，并提高固氮速率.因此，在10～20℃培养温度条件下，沉积物固氮速率随着温度的上升显著变大（图2）.当温度增加到一定程度后，固氮酶活性对温度的依赖性逐渐由强变弱，温度对固氮速率的影响也逐渐减弱.较高的呼吸速率需要为固氮酶提供非常低的氧水平，从而提高固氮过程所需的能量.同时，温度的持续升高将促进沉积物的矿化速率，沉积物释放大量的NH4+会对固氮过程产生一定的抑制作用[27].本研究也显示，当温度超过固氮过程的最适温度时，固氮速率反而有所降低.然而，CMDT沉积物固氮速率在15℃培养条件下达到最高值，而后随着温度的升高其速率表现出下降趋势.Knapp[28]提出，高浓度的无机氮会抑制固氮过程，主要是微生物直接从环境中吸收NH4+所需要的能量要比固氮过程的低.温度升高，沉积物中高浓度的NO3–为DNRA提供丰富的底物，大量的NO3–转化成NH4+[29]，而较高浓度的氨氮将会抑制固氮速率[28，30].CMDT沉积物中高浓度的硝酸盐是导致固氮速率在15℃以上温度时呈现下降趋势的主要原因.

3.2 长江口沉积物固氮过程影响因素

沉积物微生物固氮过程受多个环境因子的影响，且不同温度培养条件下的影响因素也具有一定的差异性.由表2可知，当温度高于25℃时，固氮速率与pH值有较大相关性.有研究报道指出，固氮菌最适合在接近中性的环境中生长[31-32].随着温度的升高，固氮速率与pH值的相关性增加，表明pH值可以通过调节固氮原核生物的新陈代谢过程而影响固氮速率.此外，盐度可通过转变固氮菌的结构和多样性进而影响固氮菌的新陈代谢[33].本研究中随着温度的增加，固氮速率与盐度并没有显著的相关关系，这与不同固氮菌对于盐度的敏感性不同有很大的关系.研究报道指出，Azotobacter固氮菌属在有盐或者海水的情况下将不会进行固氮，而Clostridium的固氮过程受盐度的影响不显著[21].

从表2中可以看出，温度较低时沉积物固氮速率与硫化物含量具有显著的正相关关系，而随着温度的升高，相关关系逐渐降低.这主要是因为硫酸盐还原菌将硫酸盐异化还原成硫化物的同时也参与了固氮过程[34].有研究表明，短时间培养时，硫酸盐还原菌的最适温度在2～9℃，超过最适温度后硫酸盐还原菌活性受到抑制[35]，是温度升高硫化物与固氮速率的相关性减弱的重要原因之一.同时，我们观察到沉积物中Fe2+和固氮速率具有显著的相关关系.之前的研究也表明了铁还原菌也能进行固氮[36]，且沉积物铁的可利用性取决于硫酸盐异化还原的产物H2S和HS，其能与沉积物的Fe2+形成硫铁矿（FeS2）[37].因此，随着温度增高，沉积物中可利用性Fe2+可以消耗硫酸盐还原过程中产生的硫化物，从而间接提高固氮速率.

沉积物NH4+和NO3–受到多种过程的影响，其中径流输入影响最为重要[19，38].一些研究表明NH4+和NO3–会抑制固氮过程[39].Knapp[28]研究表明，该抑制效果是因为固氮微生物将N2转化成NH4+再吸收利用比直接从环境中吸收或者将NO3–异化还原成NH4+要消耗更多的能量.本研究也發现，在10℃培养条件下，固氮速率与NO3–呈显著的负相关关系（表2）.然而，一些研究表明，在NH4+浓度较高的环境下，固氮微生物会通过产生过量的电子来维持细胞内的氧化还原状态而进行固氮作用[40].除此之外，一些研究也表明，有机质可利用性能够缓解高浓度NH4+对固氮过程的抑制作用[41].随着温度的增加，NH4+浓度与固氮速率的相关关系逐渐变大（表2），其高呼吸速率局部耗尽NH4+是促进固氮作用的重要因素.TOC对固氮过程有较大的影响[42]，其能为异养微生物提供能量[43].在5～10℃培养期间，微生物活性对于温度的敏感性较强.随着温度的升高，TOC的消耗为固氮过程提供大量的能量，而当达到最适温度甚至更高时，由于高温会破坏固氮酶的活性从而导致固氮速率与TOC呈现负相关关系.总体来看，硫化物、二价铁、NO3–和TOC是固氮过程对温度变化响应的主要环境因子.

4结论

本文基于同位素示踪技术，探讨了长江口沉积物固氮过程速率对温度变化的响应，得出主要的结论如下：

（1）研究区域内，原位温度沉积物固氮速率变化范围为0.83～2.85nmol·g–1·h–1，具有显著的空间变异性.LHK和A2站点固氮速率最高，分别为2.14nmol·g–1·h–1和2.85nmol·g–1·h–1，而BLG速率最低为0.83nmol·g–1·h–1.

（2）各个站点不同温度下固氮速率的变化范围为0.07～3.38nmol·g–1·h–1，固氮速率对温度的响应规律大致一致.从5到30℃温度变化范围内，固氮速率总体表现为先降低（5到10℃），后升高（10到20℃），再降低（20到30℃）的变化特征.

（3）硫化物、二价铁、NO3-和TOC是调节长江口沉积物固氮作用对温度敏感性的重要环境因子.