王 娟 田可可 闫 虹 杜 威 吕玉珍

河南省焦作市妇幼保健院(454000)

大多数生殖中心在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中筛选最优的第3天(D3)胚胎并使用传统形态学评分。延时摄像技术(TLI)系统作为一种新型胚胎培养及检测系统已经被越来越多的国内外生殖中心所使用[1]。TLI能使胚胎处于一个相对恒定环境，可获得传统培养方法无法得到的胚胎早期发育参数，选择最有发育潜能的胚胎，提高临床妊娠率[2-3]。但是仅使用TLI技术对胚胎的选择仍有不足，随着培养时间延长及卵裂细胞的增多，图像辨识度也会降低，若联合经典的胚胎形态学评估(CMA)效果会更佳。就目前而言，各大生殖中心选择移植胚胎的TLI各项参数指标不尽相同。本研究探讨胚胎动力学参数联合CMA选择胚胎的临床结局，并初步建立选胚模型，以期缩短诊疗时间，使患者尽早受孕。

1 对象与方法

1.1 研究对象

对2020年3月-2021年4月在本院行常规IVF-ET者进行回顾性分析。纳入标准：①女方输卵管因素不孕；②移植周期数为1，新鲜周期D3移植；③采用卵泡期长效长方案，年龄≤35岁，获卵数≥6～15枚。排除标准：取卵当天受精率低下或行补救的周期。纳入443个周期，TLI组213例，常规组230例。本研究经本院伦理委员会审批同意(20190429)，参与研究者均签署了书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 TLI系统使用ESCO(新加坡)TLI系统。

1.2.2胚胎培养方法根据患者基础内分泌水平、卵巢储备等情况按照常规促排卵方案，当1～2枚卵泡直径≥18 mm 时注射重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG，艾泽，德国默克雪兰诺)，37.5～38.0 h阴道B超引导下取卵，所获卵母细胞短时受精4h后拆蛋观察受精情况。常规组将受精卵培养皿置于COOK培养箱(6.0% CO2，5.0% O2，37.0℃)培养；TLI组置于TLI培养箱(6.0% CO2，5.0% O2，37.0℃)培养，Miri TL Viewer捕获软件拍摄间隔设置10min。在受精后18～20h 观察受精原核，44 h和68 h左右观察胚胎；D3均选择来源于2PN胚胎1 ～ 2枚,剩余可利用胚胎进行换液后继续进行培养至D6，记录囊胚形成情况。两组选胚均采用CMA。

1.2.3 CMA根据伊斯坦布尔共识对分裂期胚胎质量进行评分[4]。优质胚胎的标准和可利用胚胎评价指标参照胚胎实验室关键指标质控专家共识[5]，根据 Gardne评分系统[6]进行囊胚形态学评分，若评分3BB及以上囊胚，则判断为优质囊胚。

1.2.4 TLI胚胎观察指标受精时间为起始时间，记录原核消失时间(tPNf)，发育至2细胞时间为t2，第2、3个 细 胞 周 期 间 隔 时 间 为 cc2(t3-t2)和cc3(t5-t3)，标志第2、3次细胞分裂同步性指标分别为s2(t4-t3)、s3(t8-t5)；胚胎卵裂模式包括正常卵裂和异常卵裂(非轴性卵裂、不均卵裂、非二倍卵裂、逆卵裂、发育阻滞、卵裂球融合等)。

1.2.5妊娠观察指标及评价标准移植后常规行黄体支持。移植后14d检测血绒毛膜促性腺激素(β-hCG)，如β-hCG≥50U/L，4～6 周阴道B超下出现孕囊和胎心为临床妊娠，孕囊数与移植胚胎数之比为种植率。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 一般情况

TLI组较常规组正常受精率高(χ2=4.876，P=0.027)，其余各项指标两组相比均无差异。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 TLI 胚胎动力学参数

TLI周期213例，正常卵裂胚胎1611枚，移植胚胎288枚。

2.2.1时间参数TLI组着床(n=139)与未着床(n=149)t4、t8、s2、s3比较有差异(Z=3.255，2.443，9.175，P<0.05)，其余指标均无差异。见表2。

表2 TLI培养着床与未着床胚胎时间参数比较[h,M(P25,P75)]

2.2.2卵裂模式TLI组正常卵裂(n=725)与异常卵裂(n=886)囊胚形成率比较无差异；正常卵裂的优质胚胎率、临床妊娠率、种植率及流产率高于异常卵裂，流产率低于异常卵裂(均P<0.05)。见表3。

表3 TLI卵裂正常与异常的胚胎发育参数比较(%)

2.3 建立优选分层选胚模型及临床模型验证

2.3.1模型标准建立建模选胚指标为TLI胚胎动力学参数联合CMA。首选模型A组：细胞数7～10[10]，卵裂球均等或稍不均，碎片≤10%；正常卵裂胚胎；TLI t4≤37.00h，t8≤57.00h，s2≤0.75h，s2≤5.50h。次选模型B组：细胞数>10或4～6，卵裂球均等或稍不均，碎片≤15%；选择正常卵裂胚胎，如无正常卵裂也可选择异常卵裂中非轴性卵裂、不均卵裂胚胎；如胚胎数无8C,参考TLIt4、与s2。

2.3.2临床模型验证选择2021年5-7月与上述患者同条件及符合胚胎标准的周期65例， A组均正常卵裂53例，B组12例，有4例异常卵裂(2例不均卵裂；2例非轴性卵裂，其中1例临床妊娠)。两组获卵878枚，正常受精率78.0%(6 85/878)，优胚率52.2%(156/299)，妊娠率69.2%(45/65)，种植率56.7%(51/90)，流产率11.1%(5/45)。A组优质囊胚形成率与临床妊娠率均高于B组(P<0.05)。见表4。

表4 两组模型分层选胚参数比较

3 讨论

meta分析结果显示，采用TLI培养胚胎并结合TLI胚胎形态动力学参数选择优质胚胎，可改善IVF-ET妊娠结局[7],但是关于TLI选择胚胎能否改善临床结局，说法不一[8]，胚胎学家正致力于寻找与胚胎发育潜能及妊娠结局相关的动力学参数[9-11]。

本研究结果显示，TLI培养的胚胎正常受精率高于普通培养(74.4% 与72.0%)，优质胚胎率、临床妊娠率与种植率无差异。表明TLI可以回顾胚胎发育全过程，避免了常规培养一过式观察而错过两原核出现的时间，能增加卵子与胚胎的利用率，既为胚胎发育提供稳定的外环境，数据又具有可追溯性[12-13]。

静态形态学评估是目前大多数中心常用的评价胚胎移植前活力的方式[14]。根据伊斯坦布尔共识[4]，通常4C发生在D2受精后(44±1)h，8C在D3受精后(68±1)h。人类的合子基因组激活发生4～8 细胞阶段，此阶段的时间参数对预测胚胎发育潜能至关重要。本研究发现TLI时间参数t4、t8、s2、s3，与胚胎着床密切相关，有明显的时间缩短且同步性强，且这4项指标与静态评估主要指标仍有一致性。有文献报道，t4、s2在区分整倍体和非整倍体胚胎方面，也有时间缩短的现象[15]。有研究证实，卵裂时间相对较早，同步性好的胚胎，其发育至优质囊胚的几率更大[16-17]。以上结论进一步说明了t4、t8、s2、s3的可靠性，如果筛选这些优势时间段内的胚胎在D3进行移植，能加大获得妊娠的可能。但t4、t8与静态学观察的时间点有较明显的时间差，归其原因或许是动态观察更能及早发现发育速度快的优质胚胎，真正有潜力的胚胎，静态选择有时会忽略。

本研究中的多种胚胎异常卵裂模式都可通过 TLI得到精确记录，而在静态评分体系中这些异常卵裂常不易发现。有文献显示，胚胎发育过程中的动态卵裂模式异常可显著影响胚胎的种植率，且卵裂异常的胚胎移植后具有较高的流产率[18-19]。本研究结果表明，卵裂正常较异常的优质胚胎率、临床妊娠率、种植率、流产率有显著差异，异常卵裂的胚胎可显著影响胚胎的发育潜能，且流产率增高。此结果也能解释表1中TLI组较常规组中流产率无差异的原因，是TLI组未能将卵裂模式作为筛选指标，保留了形态学观察正常而卵裂模式异常的胚胎。再次提示了卵裂模式在D3胚胎发育结局的重要性，可作为TLI筛选胚胎的参数。

建模数据显示，正常受精率、利用胚胎率、优胚率、临床临床妊娠率、种植率较建模前TLI组及常规组均有提高。Park等[20]报道，采用TLI培养胚胎者的流产率高于采用传统培养箱培养胚胎。本文结论与其有不一致性，在表1中，与常规组对比，TLI组的早期流产率并未降低(P>0.05)，通过建模后，A、B两组总流产率较TLI组与常规组有所下降(11.1% 与14.2% 与13.7%)，A组较B组下降的较为明显(10.3%与16.7%)，虽然A组与B组数据统计学并无差异(可能与数据少有关)，但是B组中有异常卵裂4例，3例未孕，显著影响临床结局。导致流产率降低的原因，有可能是建模后排除了大部分胚胎中某些卵裂球的分裂延迟及异常卵裂[21-22]。研究中B组添加两种异常分裂模式，是因为不均卵裂及非轴性卵裂的胚胎具有较高的优质囊胚形成率[23],一是设计模型需要，二是防止纠正过多，增加取消率。数据还显示，A 组较B组优质囊胚形成率及临床妊娠率差异有统计学意义(56.0%与38.8%；73.6%与50.0%)。通过建立TLI胚胎动力学参数(时间参数与分裂模式)与形态学评估联合分层筛选，按照优质胚胎、卵裂模式、T4、T8 、s2 、s3的顺序依次进行，逐层选择好的D3胚胎移植，将移植后的剩余胚胎继续培养，以优质囊胚形成率和临床妊娠率两者相结合为最终结局，判断该分层模型的有效性，获得了最佳时间范围内卵裂的胚胎与范围之外的胚胎相比较，其优质胚胎率与临床妊娠率明显较高，提升了患者首次移植临床妊娠率。

综上所述，胚胎发育是一个动态过程，静态学选择胚胎，存在一定的局限性。但由于不同中心得出的有效指标各有不同，多中心大样本研究可能具有更加广泛的意义。本研究通过将TLI动力学参数联合胚胎形态学建模，筛选 D3胚胎移植，获得了较为理想的妊娠结局，为优化胚胎筛选流程及优质胚胎选择提供了新的参考依据。

即便如此，本研究并未对建模数据中患者持续妊娠率、活产率、新生儿围生期结局及远期预后等进行进一步比较，数据量也有不足，故具有一定局限性，将进一步扩大样本量，根据产科、新生儿随访数据进一步证实，以确保此方法的有效性和安全性。