刘 娜 李 品 王齐霞 李明明 黄淑红 党宁宁

1潍坊医学院，潍坊，261000；2山东第一医科大学附属济南市中心医院，济南，251003；3山东第一医科大学(山东省医学科学院)医学科技创新中心，济南，250117；4山东第一医科大学(山东省医学科学院)基础医学院，济南，250117；5山东第一医科大学附属省立医院，济南，250021

转移性黑素瘤的预后很差，五年生存率<25%[1]，直到近年来才出现有限的治疗选择[2]。基因组测序结果显示，黑素瘤比其他实体肿瘤具有更高的突变性[3]。BRAF激酶编码基因突变占黑素瘤发生的40%～60%，且最常见的致癌突变基因为V600E[3]。维莫非尼是一种竞争性激酶抑制剂，对具有V600E等突变的BRAF激酶具有活性，它通过与突变BRAF的ATP结合结构域结合来发挥其功能；而达帕非尼是一种可逆的ATP竞争性激酶抑制剂，靶向MAPK途径。二者均可以有效抑制V600E突变的BRAF蛋白[4]。尽管延长黑素瘤患者无进展生存期和总生存期的方法已经出现，但有效率却存在很大差异。患者对抑制剂产生耐药性可能是造成这些差异的原因[7]，而有研究显示，人类Eph受体家族可能与这种耐药性的产生有关。

人类Eph受体家族目前有14个成员，它们构成最大的受体酪氨酸激酶家族[8]。这些Eph受体及其ephrin配体参与了多种发育功能，包括脊椎动物的后脑发育、组织发育和血管生成[9]。过表达Eph受体及其Ephrin配体的各种成员在癌症中经常被报道。相比之下，另一种激酶缺陷受体EphB6在黑素瘤[11]、乳腺癌和前列腺癌[12]等最具侵袭性的细胞系中表达下调，这表明EphB6与其他家族成员相比具有独特的作用。

本研究将揭示过表达EphB6和BRAF抑制剂(BRAFi)在侵袭性黑素瘤细胞增殖和侵袭中的协同作用。

1 材料与方法

1.1 数据库分析 GSE141484是7个与BRAFi治疗前后相匹配的黑素瘤组织的基因表达谱。GSE22838是对6例BRAF野生型和5例BRAF突变型黑素瘤患者的基因表达分析。基于log2(Fold变化)>1或<-1，及双尾T检验P值<0.05，对差异表达基因进行筛选。维莫非尼的316个基因和达帕非尼的330个基因从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载。

1.2 细胞培养与处理 从ATCC(马纳萨斯，VA，USA)获得375和1205Lu细胞(BRAFV600E突变，无NRAS突变)，用含10%胎牛血清和1% Pen/Strep的DMEM高糖(HyCloneSH30243.01)在37℃和5%二氧化碳的培养箱中培养。将EphB6cDNA克隆到pcDNA3.1质粒中，用Lipo2000试剂转染细胞。维莫非尼(10μM)和达帕非尼(1μM)购自Selleck.cn。

1.3 蛋白免疫印迹分析 使用含有混合蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。裂解液在冰下孵育10分钟，接着在4℃，12 000 g的条件下离心10 min。采用BCA法测定每个样品的蛋白浓度。样品装载在SDS-PAGE上。电……