张龙飞，杨苑鹤，沈 童，叶 灵，吴占月，王梦杰，吴 华

(青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

巨噬细胞是机体免疫系统中重要的组成部分，其主要功能是吞噬细胞、参与抗原处理、消灭各种病原微生物及抗肿瘤等。细胞自噬和细胞凋亡是细胞自主走向死亡的两种主要方式，细胞凋亡是受多基因复杂调控的细胞程序化死亡，细胞自噬是一种在真核生物中高度保守的细胞内整体降解系统[1]。JNK信号通路是MAPK信号通路的重要分支，它在细胞周期、细胞自噬、细胞凋亡及细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用[2]。

青海特色药用野生植物黑枸杞(LycuumruthenicumMurr)的主要活性成分为花青素(Anthocyanins，AC),花青素存在于植物细胞的液泡中，属类黄酮的酚类物质，具有护肝、抗炎、抗氧化、降血糖、提高免疫力等多种生物功效[3-5]。曹柏营等[4]研究发现，花青素可以提高巨噬细胞的吞噬功能，增强小鼠免疫力。武强等[1]研究发现花青素能促进巨噬细胞RAW264.7增殖，抑制细胞自噬，提高小鼠免疫力。大量研究发现花青素可以促进巨噬细胞的增殖、抑制巨噬细胞的自噬，但对于巨噬细胞凋亡与自噬相互作用的研究较少。本研究基于JNK信号通路探究黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡与自噬的相互调节作用及相关分子机制，为黑枸杞花青素对细胞水平的免疫功能机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海细胞库；黑枸杞花青素购自青海金麦杞生物科技有限公司(花青素64.4%、蛋白6%、糖1.32%、氨基酸3.56%、灰分0.6%、其他24.12%)[5]。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制 黑枸杞花青素溶液配制：取0.01 mg黑枸杞花青素于DMEM培养基中避光溶解，配成100 μg/mL的花青素母液于4 ℃冰箱避光保存备用；JNK抑制剂SP600125溶液配制：取1 mg SP600125溶于DMEM培养基中，配成1 mmol/L的SP600125母液于4 ℃冰箱保存备用(本试验SP600125终浓度为10 μmol/L)；3-MA抑制剂溶液配制：取0.015 g 3-MA溶于DMEM培养基，37 ℃培养箱溶解2 h，配成100 mmol/L的3-MA母液于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 细胞培养 将RAW264.7放置于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，然后在37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行常规培养，待细胞生长70%～80%融合时进行传代培养。收集对数生长期细胞悬液0.1 mL于1.5 mL离心管，加0.8 mL PBS与0.1 mL 0.4%台盼蓝染液，摇匀，室温放置2～3 min后置于血球计数板，在显微镜下计数。

1.2.3 细胞分组及处理 细胞计数后，以每孔1×106个细胞接种到24孔培养板，分为分组1：对照组(0 μg/mL)、花青素组(25 μg/mL)、花青素(25 μg/mL)+SP600125(10 μmol/L)组、SP600125组(10 μmol/L)；分组2：对照组(0 μg/mL)、花青素组(25 μg/mL)、花青素(25 μg/mL)+3-MA(5 mmol/L)组、3-MA组(5 mmol/L)。每组3个复孔，分组处理后常规培养24 h收集细胞。

1.2.4 DAPI、Hoechst检测细胞核形态 以每孔4×104个细胞接种到24孔培养板，按分组2处理后进行培养；PBS洗涤2次后用4%甲醛固定，加入DAPI、Hoechst染液分别于室温孵育15、30 min后用PBS洗涤2次，使用倒置荧光显微镜观察。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 以每孔1×106个细胞接种到24孔培养板，按分组2处理后进行培养；PBS洗涤2次，悬浮于100 μL的1×结合缓冲液，5 μL AV-FITC及10 μL PI室温避光染色15 min，加入400 μL的1×结合缓冲液后使用流式细胞仪进行分析。

1.2.6 RT-qPCR检测JNK信号通路因子JNK及凋亡与自噬相关因子mRNA的表达 用TRNzol法分别提取各分组细胞总RNA并进行完整性检测及浓度检测，随后按照天根公司的cDNA反转录试剂盒操作说明书进行RNA反转录，以β-actin作为内参采用SYBR Primescript TM试剂盒进行定量PCR分析，引物序列如下：β-actin：5′-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3′(正向)，5′-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3′(反向)；JNK：5′-CGCCTTATGTGGTGACTCGCTAC-3′(正向)，5′-CTCCCATGATGCACCCAACTGAC-3′(反向)；Caspase-3：5′-AGTGGGACTGATGAGGAGATGGC-3′(正向)，5′-ATGCTGCAAAGGGACTGGATGAAC-3′(反向)；Bcl-2：5′-CCGTCGTGACTTCGCAGAGATG-3′(正向)，5′-ATCCCTGAAGAGTTCCTCCACCAC-3′(反向)；Bax：5′-ACGCATCCACCAAGAAGC-3′(正向)，5′-GCCACACGGAAGAAGACC-3′(反向)；LC3-Ⅱ：5′-TGTGTCCACTCCCATCTCCGAAG-3′(正向)，5′-CCATTGCTGTCCCGAATGTCTCC-3′(反向)；Beclin-1：5′-GACACGAGCTTCAAGATCCTGGAC-3′(正向)，5′-CCTCCTGGGTCTCTCCTGGTTTC-3′(反向)。

1.2.7 Western Blot检测JNK信号通路因子p-JNK及自噬因子LC3-Ⅱ蛋白表达 分别提取各分组细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度；使用SDS-PAGE电泳后，转膜及封闭，加入一抗(p-JNK抗体或LC3-Ⅱ抗体)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(山羊抗IgG)，室温孵育1 h后洗膜、显影、定影；使用Image J对条带吸光度(A)值进行分析。

1.2.8 MDC染色检测细胞自噬小体 以每孔1×105个细胞接种到24孔培养板，按分组1处理后进行培养，24 h后收集细胞；用300 μL的1×Wash buffer清洗细胞1次，800 g离心5 min，弃上清，加入适量的1×Wash buffer重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106个/mL，取90 μL的细胞悬液至新的EP管中，加入10 μL的MDC Stain，轻轻混匀，室温避光染色45 min；800 g离心5 min，收集细胞，用300 μL的1×Wash buffer清洗细胞1次，弃上清，加入100 μL的1×Wash buffer重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0进行统计学分析，应用one-way ANOVA选择Duncan′s法进行多重比较，试验结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示，利用GraphPad Prism 8.0绘图软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 黑枸杞花青素结合3-MA对RAW264.7细胞核形态的影响

如图1所示，各组细胞均具有圆形的均质核，没有形态变化的单层细胞，未表现出典型的凋亡特征，且花青素+3-MA组细胞数量显著多于对照组，这说明在抑制RAW264.7细胞自噬的同时，花青素可促进细胞增殖，减少细胞凋亡。

图1 黑枸杞花青素结合3-MA对RAW264.7细胞核形态的影响Fig.1 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the nuclear morphology of RAW264.7

2.2 黑枸杞花青素结合3-MA对RAW264.7细胞凋亡率的影响

如图2所示，与对照组相比，花青素组、3-MA组显著抑制RAW264.7细胞凋亡(P<0.05)，花青素+3-MA组可极显著抑制RAW264.7细胞凋亡(P<0.01)；与3-MA组相比，花青素+3-MA组可显著抑制RAW264.7细胞凋亡(P<0.05)。

图中与对照组相比，*为P<0.05，**为P<0.01；与3-MA组相比，#为P<0.05，下同。图2 黑枸杞花青素结合3-MA对RAW264.7细胞凋亡率的影响Fig.2 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the apoptosis rate of RAW264.7

2.3 黑枸杞花青素结合3-MA对凋亡因子Caspase-3、Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2 mRNA表达的影响

如图3所示，与对照组相比，花青素组显著降低Caspase-3、Bax的mRNA表达(P<0.05)，3-MA组与花青素+3-MA组极显著降低Caspase-3、Bax的mRNA表达(P<0.01)；花青素组显著增高Bcl-2 的mRNA表达(P<0.05)，3-MA组与花青素+3-MA组极显著增高Bcl-2的mRNA表达(P<0.01)；花青素组、3-MA组与花青素+3-MA组极显著降低Bax/Bcl-2的mRNA表达(P<0.01)。与3-MA组相比，花青素+3-MA组显著降低Caspase-3、Bax与Bax/Bcl-2的mRNA表达(P<0.05)，显著增高Bcl-2的mRNA表达(P<0.05)。

图3 黑枸杞花青素结合3-MA对凋亡因子Caspase-3、Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2 mRNA表达的影响Fig.3 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the expression of apoptosis factors Caspase-3，Bcl-2，Bax and Bax/Bcl-2 mRNA

2.4 黑枸杞花青素结合3-MA对JNK信号通路因子JNK mRNA表达的影响

如图4所示，与对照组相比，花青素组与3-MA组显著降低JNK的mRNA表达(P<0.05)，花青素+3-MA组极显著降低JNK的mRNA表达(P<0.01)。与3-MA组相比，花青素+3-MA组显著降低JNK的mRNA表达(P<0.05)。

2.5 黑枸杞花青素结合3-MA对JNK信号通路因子p-JNK蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组相比，花青素组显著降低p-JNK的蛋白表达(P<0.05)，3-MA组与花青素+3-MA组极显著降低p-JNK的蛋白表达(P<0.01)。与3-MA组相比，花青素+3-MA组显著降低p-JNK的蛋白表达(P<0.05)。

图5 黑枸杞花青素结合3-MA对JNK信号通路因子p-JNK蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the protein expression of JNK signaling pathway factor p-JNK

2.6 黑枸杞花青素结合SP600125对RAW264.7细胞自噬的影响

经过MDC染色后，细胞内的自噬体可被染色并在荧光显微镜下发出绿色荧光，荧光的聚积程度反映细胞自噬的水平，结果如图6所示。对照组内含有少量荧光，花青素组的荧光明显减少,SP600125组、花青素+SP600125组几乎看不到荧光。表明黑枸杞花青素可以抑制RAW264.7细胞自噬体的聚集。

图6 黑枸杞花青素结合SP600125对RAW264.7细胞自噬的影响Fig.6 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with SP600125 on the autophagy of RAW264.7

2.7 黑枸杞花青素结合SP600125对自噬因子LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表达的影响

如图7所示，与对照组相比，花青素组、SP600125组与花青素+SP600125组显著降低Beclin-1的mRNA表达(P<0.05)；花青素组、SP600125组显著降低LC3-Ⅱ的mRNA表达(P<0.05)，花青素+SP600125组极显著降低LC3-Ⅱ的mRNA表达(P<0.01)。与SP600125组相比，花青素+SP600125组显著降低LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达(P<0.05)。

图中与对照组相比，*为P<0.05，**为P<0.01；与SP600125组相比，#为P<0.05，下同。图7 黑枸杞花青素结合SP600125对自噬因子LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表达的影响Fig.7 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with SP600125 on the expression of autophagy factors LC3-Ⅱ and Beclin-1 mRNA

2.8 黑枸杞花青素结合SP600125对自噬因子LC3-Ⅱ蛋白表达的影响

如图8所示，与对照组相比，花青素组显著降低LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.05)，SP600125组与花青素+SP600125组极显著降低LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.01)。与SP600125组相比，花青素+SP600125组显著降低LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.05)。

图8 黑枸杞花青素结合SP600125对自噬因子LC3-Ⅱ蛋白表达的影响Fig.8 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with SP600125 on the protein expression of autophagy factor LC3-Ⅱ

3 讨论与结论

文献[6-8]研究发现JNK磷酸化后能促进Bax的表达，Bax和Bcl-2属于Bcl-2基因家族成员，Bax的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于死亡，而Bcl-2能抑制线粒体内源性核酸内切酶及诱凋亡因子细胞色素C的释放，干扰Caspase-3活化来发挥抗凋亡的作用，认为Bcl-2可能抑制了Caspase-3的合成[8-10]。本研究中花青素结合3-MA诱导RAW264.7 24 h后未发现明显凋亡形态，但细胞数量增多，凋亡率显著下降(P<0.05)，进一步研究发现花青素结合3-MA能显著降低JNK信号通路因子JNK的mRNA表达及p-JNK的蛋白表达(P<0.05)，显著降低Caspase-3及Bax的mRNA表达(P<0.05)，显著升高Bcl-2的mRNA表达(P<0.05)，显著降低了Bax与Bcl-2的mRNA比值(P<0.05)，这说明花青素结合3-MA后能通过JNK信号通路抑制RAW264.7的细胞凋亡。

SP600125主要通过抑制JNK磷酸化从而发挥抑制JNK信号通路的作用[11-13]，JNK信号通路通过对自噬因子Beclin-1与抗凋亡因子Bcl-2相互作用的影响来调节细胞自噬[14-15]。本研究中花青素结合SP600125处理RAW264.7 24 h后观察不到自噬体聚集现象，进一步研究发现花青素结合SP600125能显著降低LC3-Ⅱ的mRNA及蛋白表达(P<0.05)，显著降低Beclin-1的mRNA表达(P<0.05)，这说明花青素结合SP600125能抑制RAW264.7的细胞自噬且与JNK信号通路有关。

综上所述，黑枸杞花青素可通过JNK信号通路对RAW264.7细胞凋亡与细胞自噬的相互关系进行调控，发挥对小鼠巨噬细胞的保护作用，增强小鼠免疫力。