裘雪丹 李情操,* 吴巧萍 易泽源

(1 宁波大学医学院，宁波 315040；2 宁波市医疗中心李惠利医院，宁波 315040)

肺炎克雷伯菌为条件致病菌，常寄居于肠道和上呼吸道，是医院感染的重要致病菌之一，近年来碳青霉烯类抗生素大量使用，使得耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)比例逐年增加，CRKP已经成为临床严重感染主要原因之一，其可选择的抗菌药物有限，致病性强，可导致肺部感染、泌尿道感染、血流感染和化脓性脑膜炎等疾病，其中由CRKP引起的血流感染的病死率可高达50%～70%[1]，给临床用药和治疗带来了极大的挑战[2-3]。临床上CRKP对常用的抗生素如β-内酰胺类、四环素类等敏感性下降，而对多黏菌素有较高的敏感性[4]。目前实验室检测多黏菌素B的方法主要有微量肉汤稀释法、仪器法、E-test法和纸片法。肉汤稀释法作为参考方法，操作复杂，不适合批量检测；仪器法操作简单，目前已在实验室大量开展；E-test法成本较高，纸片法成本低，但均易受MH琼脂和纸片厂家影响，同时目前尚无关于肺炎克雷伯菌对多黏菌素B的K-B法直径折点判断标准。文本主要研究不同方法检测在CRKP对多黏菌素B体外药敏检测中存在的差异，同时建立K-B法直径和MIC值的回归方程，为临床治疗和实验室检测提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

选择2018年1月—2020年6月份宁波地区多中心医院临床非重复分离的CRKP菌株147株，作为实验菌株，其标本来源包括痰液、血液、引流液、创面分泌物和中段尿等。本次研究用菌株经肉汤稀释法作碳青霉烯耐药确认。本次实验药敏检测质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853，购自卫生部临检中心。

1.2 仪器和试剂

选择法国梅里埃公司VITEK 2全自动细菌鉴定药敏仪和中国定制药敏卡N335，纸片扩散法(K-B)药敏检测纸片多黏菌素B(100/10μg/片)选自英国Oxiod公司，肉汤稀释法和E-test法药敏试剂选自温州康泰公司，分离培养基哥伦比亚血琼脂平板和药敏培养基MH琼脂平板均为法国生物梅里埃公司生产。

1.3 方法

1.3.1 仪器法

菌种的鉴定和药敏按照VITEK 2型全自动微生物分析仪标准操作指南，先挑取待鉴定实验菌株单个菌落，使用含4.5% NaCl的无菌水调制菌液至1.5×108CFU/mL，使用VITEK 2配套的细菌鉴定卡片GN、药敏卡N335进行菌种鉴定和药敏检测。

1.3.2 肉汤稀释法

挑取待鉴定实验菌株单个菌落用无菌水调制至1.5×108CFU/mL，吸取上述调好的菌落加入液体药敏试验培养基中，菌液比例为1:200(如2 mL的培养基，加10 μL的菌液)，充分混匀后每孔加100 μL。35℃培养箱隔夜培养16～20 h后取出进行结果判读。孔内培养液澄清表示不生长；反之，培养液变浑浊或显色则表示生长。不生长孔为最低抑菌浓度(MIC)。如出现跳孔现象，排除污染情况下以最后一孔为准。CRKP对多黏菌素B的MIC折点按照2020年CLSI判断标准为2～4 μg/mL。

1.3.3 E-test纸片法

用无菌棉签取1.5×108CFU/mL菌悬液，于M-H培养基上均匀涂布，将纸片垂直插入培养基，插入后不再转移。35℃培养箱隔夜培养16～20 h后取出进行结果判读。培养基表面水滴状抑菌圈环尖所指向的浓度值即为检测菌的最低抑菌浓度(MIC)。抑菌圈环尖指向两个齿轮之间或环尖指向有高低差时取较大的值。

1.3.4 K-B法

用无菌棉签取1.5×108CFU/mL菌悬液，于M-H培养基上均匀涂布，贴好药敏纸片35℃培养箱隔夜培养18～24 h后，量取纸片抑菌环直径。采用大肠埃希菌 ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853对M-H培养基与药敏纸片进行质控监测，检测结果均在控。

1.3.5 药敏结果分析

以标准方法肉汤稀释法检测结果为参考：①基本一致率(EA)：两种方法检测的MIC值相同或相差±1个稀释度；②标准符合(CA)：按照相同折点标准，敏感、中介、耐药一致的菌株百分比；③严重错误(VME)：参考方法药敏结果为R，而被评估方法结果为S，即“假敏感”；④重大错误(ME)：参考方法药敏结果为S，而被评估方法结果为R，即“假耐药”；⑤小错误(mE)：参考方法结果为I，而被评估方法药敏结果为S或R。按照CLSI文件要求，可接受的误差范围为：EA和CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[5]。

1.4 统计学处理

应用WHONET5.6软件和SPSS 18.0统计软件对临床菌株的数据资料进行统计分析，两种方法检测MIC值比较使用wilcoxon符号秩和检验；两种方法检测抗菌药物敏感性的比较使用卡方检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 肉汤稀释法、E-test法和仪器法检测多黏菌素B药敏结果

肉汤稀释法、E-test法和仪器法检测CRCP对多黏菌素B累计敏感率分别为97.3%、99.3%和98%。肉汤稀释法和E-test法检测CRCP对多黏菌素B MIC50和MIC90均为1 μg/mL，仪器法的MIC50和MIC90较微量肉汤稀释法均低1个稀释度(0.5μg/mL)(表1和图1)。

表1 对CRKP的3种MIC检测方法的结果分布(株)、累积率(%)及MIC50、MIC90值(μg/mL)Tab.1 Results distribution, cumulative rate (%) and MIC50,MIC90(μg/mL) by three testing methods of MIC for CRKP

2.2 肉汤稀释法、E-test法和仪器法检测多黏菌素B药敏结果敏感性比较

微量肉汤稀释法、E-test法和仪器法检测多黏菌素B的敏感率分别为97.3%、99.3%和98.0%。卡方检验结果P1、P2均大于0.05，显示仪器法、E-test法与肉汤稀释法相比敏感性无差异(表2)。

表2 对CRKP的3种MIC检测方法的敏感性结果比较 [n(%)]Tab.2 Comparison of sensitivity results by three testing methods of MIC for CRKP[n(%)]

2.3 肉汤稀释法、E-test法和仪器法检测多黏菌素B MIC值结果比较

肉汤稀释法、E-test法、仪器法的MIC值分别为(1.39±0.27)μg/mL、(1.02±0.06)μg/mL、(0.82±0.16)μg/mL。仪器法检测CRKP对多黏菌素B的MIC值明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)(表3)。

表3 对CRKP的3种MIC检测方法的MIC值结果比较(x_±s)Tab.3 Comparison of the MIC values by three testing methods of MIC for CRKP(x_±s)

2.4 E-test法和仪器法与肉汤稀释法检测多黏菌素B敏感性的方法学误差比较

以肉汤稀释法作为参考方法，按照FDA判断标准，E-test法和仪器法的EA率为93.2%和95.2%，CA率分别为98.0%和99.3%，VME率分别为2.0%和0.7%；ME率和mE率均为0(表4)。

表4 E-test法和仪器法与肉汤稀释法检测多黏菌素B敏感性的方法学误差比较(%)Tab.4 Incidence of errors between E-test method、instrument method and broth microdilution(%)

2.5 纸片法抑菌环直径结果与肉汤稀释法MIC结果回归统计比较

KB法抑菌圈直径和肉汤稀释法KB值与肉汤稀释法MIC值之间方差分析P＞0.05，故提示KB值与MIC值不存在线性关系(表5和图2)。

表5 纸片法抑菌环直径结果与肉汤稀释法MIC检测多黏菌素B药敏结果回归方程Tab.5 Regression equation between the results of the KB value and the MIC value of polymyxin

3 讨论

近年来碳青霉烯类抗生素大量使用，使得耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)比例逐年增加，CRKP已经成为临床严重感染主要原因之一。CRKP耐药性的获得途径有产碳青霉烯酶和外膜蛋白的缺失，膜通透性改变以及外排泵过表达等，这给临床的抗感染治疗带来了巨大的难题[6]。多黏菌素B是一种多肽类抗生素，有其独特的化学结构和作用机制，并拥有高效抗菌活性，已经成为治疗CRKP的重要选择[7]。目前实验室检测多黏菌素B的方法主要有微量肉汤稀释法、仪器法、E-test法。不同的药敏检测方法各有优缺点，本文主要采用上述4种方法检测多黏菌素B对宁波地区多中心医院临床非重复分离的CRKP的体外敏感性的差异性进行分析讨论，为临床治疗和实验室检测提供依据。

不合理的用药使得多黏菌素耐药菌株也不断出现[8]，微量肉汤稀释法能够经济有效准确的检测出病原菌的最低抑菌浓度，是药敏试验的参考方法。本研究中微量稀释法结果显示，多黏菌素B对CRKP具有较高的抗菌活性，这与其他学者的研究[9-10]结果一致。E-test法和仪器法其累积敏感率均较高，与微量稀释法结果较一致，有较高的可靠性，但在出现有疑问的药敏结果或结果不相符合时，应尽量采用微量肉汤稀释法复核。

准确的MIC值对于临床抗生素敏感性指导治疗更有意义[11]。肉汤稀释法虽为参考方法，结果准确但操作复杂且成本较高，不适合临床实验室大量开展[12]。因此替代方法的准确性尤为重要。本实验采用的是插入式E-test试纸条，不会产生气泡等干扰因素，读取结果更简便[13]，以微量肉汤稀释法MIC值作为参考方法进行比较，E-test法检测CRKP对多黏菌素B的MIC值无明显差异，故临床实验室可采用E-test法对多黏菌素B进行常规的敏感性检测。仪器法检测CRKP对多黏菌素B的MIC值显著降低，这与335药敏卡其他抗菌药物报道类似[14]，所以此种方法报告的敏感结果应谨慎，必要时进行相关验证和复核。

与肉汤稀释法相比，E-test法和仪器法的EA和CA均＞90%，高于CLSI参考标准，无Me和me，但均存在VME，E-test法的VME＞1.5%，高于参考标准，其原因易受多种因素影响，如抗生素含量、其扩散能力、琼脂厚度和成分以及人工操作可能的误差，所以实验人员应严格按照SOP规范进行药敏操作。

目前国内微生物实验室主要使用仪器法和Etest法来检测CRKP对多黏菌素B的MIC值，关于肺炎克雷伯菌对多黏菌素B的纸片扩散法的判断折点CLSI尚无明确。但对于多重耐药菌株的出现，尤其是CRKP，以多黏菌素B为主的联合用药是当下研究的重点[15]，纸片扩散法在联合药敏对多重耐药菌的研究中极其重要。本研究为了明确K-B法检测效果，采用纸片扩散法对147株CRKP的抑菌圈进行对比研究。与肉汤稀释法对比发现，对于多黏菌素B耐药或敏感CRKP菌株，其纸片抑菌圈直径并没有出现明显减小或扩大。究其原因主要是多黏菌素B是多组分结构，分子量较大，故在琼脂中不易扩散，此外还有其固有的阳离子特性等影响的因素[16]。所以，K-B法作为传统检测方法，并不适合于多黏菌素B的敏感性判断，与参考方法测得MIC值回归曲线的拟合程度也并不高。本研究受限于本次菌株数量原因，有待进一步的完善。