饶静秋 魏平凡 杨 云 蓝俊麟 刘小龙 袁智勇

（1.西南林业大学云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，云南 昆明 650233；2.文山市国家级自然保护区管护分局，云南 文山 663099；3.云南文山国家级自然保护区管护局，云南 文山 663099）

长吻臭蛙（Odorrana nasica）隶属于两栖纲（Amphibia）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）臭蛙属，模式产地为越南谅山省母山（海拔范围915～1 220 m）[1]。根据Frost 等的研究表明，在越南河静省（105°14′38″ E,18°20′53″ N,海拔范围900～1 200 m）也有该蛙分布[2]。长吻臭蛙是一种小型臭蛙，体背荐椎之后皮肤粗糙，腹面皮肤光滑，吻部极突出，颊部深凹。活体背面为棕色或具灰橄榄绿色相间，具一条窄的腺状背侧褶，部分个体具有深色斑；腹面黄白色，具不太明显的棕色点；吻端及大腿后皮肤为黄色及橄榄绿相间的不规则斑纹。

目前，该物种在国外分布于泰国西北部和越南北部[3]。尽管该种被认为在中国也有分布[3]，但目前尚未有相关文献证实。该物种在国内的具体分布地点、形态特征以及相应的生境均不清楚。本研究在2018 年7 月和2021 年2 月，分别在云南省文山壮族苗族自治州马关县及西畴县采集到3 只臭蛙属标本，根据上述主要鉴别特征对比及分子生物学鉴定，确定采集物种为长吻臭蛙。通过对新采集的3 号长吻臭蛙标本进行了相应的形态特征测量及描述，并对2 个采集地的生境进行了描述，证实该物种在国内的分布记录，并补充了具体分布情况及相应的生境介绍。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2018 年7 月和2021 年2 月，分别在云南省文山州马关县都龙镇四台坡（104°33′47″ E,22°55′12″ N,海拔1 417 m）附近采集到雌性臭蛙标本2 号（标本号SWFU 0048,SWFU 0049）；在西畴县法斗乡文山国家级自然保护区小桥沟片区（104°45′45″ E,23°21′36″ N,海拔1 518 m）采集到雄性标本1 号（SWFU 006976），并收集脚趾样品3 号（组织号Yuan 10161、Yuan 10162、Yuan 10185）。所采集的标本取出肌肉及脚趾样品均储存在95 %乙醇中以用于后续的分子实验。整体标本固定保存于75 %乙醇中，并保存于西南林业大学。

1.2 形态学测量

依据文献[4−5] 的测量方法，用数显卡尺对2 个成年雌性及一只雄性标本进行形态学测量，精确到0.1 mm。测量指标：体长（SVL），自吻端至体后端的长度；头长（HL），自吻端至上、下颌关节后缘的长度；头宽（HW），最大头部宽度；吻长（SL），自鼻间到眼孔前角的长度；鼻间距（INS），左右鼻孔内缘之间的距离；眼间距（IOS），左、右上眼睑内侧缘之间的最窄距离；眼径（ED），与体轴平行的眼球外露部分的直径；上眼睑宽（UEW），上眼睑最大宽度；鼓膜径（TD），鼓膜的水平直径，测量到鼓膜边缘的外缘；鼓膜到眼睛距离（TEY），自眼孔的后缘至鼓膜边缘的前缘；手长（HND），自手掌结节基部至Ⅲ指指尖；股骨长度（FEM）；胫骨长度（TIB）；跗足长（LFT），从胫骨跗骨关节到IV 趾趾尖；足长（FL），从跖骨内结节基部至IV 趾趾尖；第III 指指吸盘的水平直径（F3DSC）。

1.3 分子系统发育分析

本研究采集了2 号标本的肌肉组织（标本号SWFU 571、SWFU 572）及3 号脚趾样品（Yuan 10161、Yuan 10162、Yuan 10185），采 用ThermoFisher Scientific 公司所提供的DNA 提取试剂盒的提取方案来提取该物种DNA，然后 −20 ℃保存备用。使用引物16SAR（5′−CGC CTG TTT ACC AAA AAC AT−3′）和16SBR（5′−CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T−3′），对其16S rRNA基因进行扩增[6]。聚合酶链式反应（PCR）程序为95 ℃预热10 min，95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，进行35 个循环，最后72 ℃延伸7 min；PCR 扩增产物最后送至上海生工生物工程有限公司测序。测序后得到的结果使用DNASTAR Lasergene.v7.1 软件包中的Seqman程序进行比对[7]。将已比对16S rRNA 序列数据上传至GenBank 数据库 （GenBank 号：OK464876-OK464880）

基于已比对的16S 序列数据，本研究采集的臭蛙标本属于Liu[5]和Chen 等[8]揭示的臭蛙属7 个进化支（A−G）中F 支系内的物种。因此，从GenBank 下载臭蛙属该支系的全部7 个物种，共7 条序列，并采用F 支系的最近姐妹支系中的大绿臭蛙（Odorrana graminea,Boulenger 1899）的序列作为外群[8]。本研究同时使用了贝叶斯法（BI）和最大似然法（ML）进行系统发育分析，构建系统发育树。运用JModelTest 2 选择最合适的模型构建ML 树和BI 树[9−10]，为GTR+G。使用RAxML 8.2.4 版本运行最大似然估计（ML）[11]，在ML 分析下使用非参数自助重取样重复1 000 次来评估自引支持度，采用MrBayes 3.2 进行贝叶斯系统发育分析[12]。使用4 条马尔科夫链运行2 000万代，每1 000 代进行1 次抽样，基于收敛的情况，前25 % 代数舍弃掉。使用Tracer v 1.5[13]来检测有效样本量（ESS200）以检查各运行参数值是否收敛，应用MEGA X 计算种内及种间遗传距离（p−distance）[14]。

2 结果与分析

2.1 形态描述

本次采集的2 只雌性长吻臭蛙成体体长分别为75.7 mm 及71.3 mm，雄性长吻臭蛙成体长为49.3 mm，其余各部位量度数据见表1。头部宽度小于头部长度；吻部较扁平，吻端在背视图中稍钝圆，突出于下颌外；鼻部深凹，鼻孔背外侧到眼睛及吻端距离相等；吻棱明显；鼻间距大于眼间距；吻长大于眼径；鼓膜非常清晰，鼓膜边缘相对于鼓膜稍高；鼓膜径明显小于眼径；眼间距略小于上眼睑宽；松果体可见；犁骨齿略呈倾斜，位于内鼻孔之间；内鼻孔呈椭圆形，接近犁骨齿；舌后端缺刻深，呈“U 形”（图1～3）。

表1 云南马关县及西畴县长吻臭蛙雌性及雄性成体量度Table 1 Measurements of the adult specimens of O.nasica

图1 长吻臭蛙（云南省西畴县法斗乡，雄性）Fig.1 O.nasica (Fadou Town of Xichou County,Yunnan Province,male)

雄性成蛙体背荐椎之后包括背侧褶之下的体侧面密布圆锥状刺（图1），雌性成蛙该区域布稀疏疣粒（图2）。活体背面为棕色或具灰橄榄绿色相间，部分个体具有深色斑，具一条窄的腺状背侧褶。吻棱及腺状侧褶外边缘呈黑色；鼻孔下方至上唇白色，鼓膜微红；四肢具数条规则的黑色横条纹；腹面黄白色，具不太明显的棕色点；吻端及大腿后皮肤为黄色及橄榄绿相间的不规则斑纹（图2～3）。标本浸泡后背部呈棕红色，体侧颜色略深于体背呈棕黑色，腹面呈白色。

图2 长吻臭蛙（云南省马关县都龙镇，SWFU 0048，雌性）Fig.2 O.nasica (Dulong Town of Maguan County,Yunnan Province,SWFU 0048,female)

图3 长吻臭蛙手部及足部形态（云南省马关县都龙镇，SWFU 0048，雌性）Fig.3 Hands and foots of O.nasica (Dulong Town of Maguan County,Yunnan Province,SWFU 0048,female)

长吻臭蛙雌雄差异较大，雄性体型小于雌性，且体长约为雌性体长的70 %；雄性肱腺缺失，具有一对咽侧下外声囊；雄性成体第一指基部粗大，婚垫发达；体背荐椎之后包括背侧褶之下的体侧面密布圆锥状刺。

2.2 生境描述

本研究中所采集的长吻臭蛙样本序列与已有长吻臭蛙序列[4]聚在同一支系，与安子山臭蛙（Odorrana yentuensis）形成姐妹群关系。种内遗传距离（p-distance）为1.1 %，与姐妹种间遗传距离为2.8 %，系统发育分析的结果显示采集于马关县和西畴县的臭蛙标本为长吻臭蛙（图4）。

图4 基于线粒体16s rRNA 构建臭蛙属F 支系的贝叶斯树Fig.4 Bayesian inference tree of Odorrana derived from 16s rRNA sequences

3 结论与讨论

本研究在云南文山州采集到的长吻臭蛙标本与该蛙模式产地越南谅山省母山（Mau Son Mountains,Lang Son province,Vietnam）的标本在外部形态描述上基本一致。马关县采集到的长吻臭蛙标本均为雌性，与西畴县采集到的雄性标本相比雌性体长明显大于雄性（马关县长吻臭蛙雌性体长：71.32～75.7 mm；西畴县长吻臭蛙雌性体长：49.3 mm），雄性成蛙体长约为雌性的70 %。西畴县采集到的雄蛙与模式标本记录的4 只雄性相比体长及形态特征描述均一致。系统发育分析的结果显示，采集于马关县和西畴县的臭蛙标本均为长吻臭蛙。基于以上结果，本研究证实了长吻臭蛙在中国云南省文山州的分布。

长吻臭蛙的繁殖季节推测应该在2—4 月。研究人员于2016—2018 年的4、6、8 月在西畴县监测期间均没有见到该蛙的成体，也没有听到该蛙的叫声。仅于2017 年4 月初监测期间发现有雌性成体（未采集），而在2021 年2 月初考察期间见到大量雄性个体及少量雌性个体，叫声颇多，但未见到抱对个体或卵团，推测应该是在繁殖早期，后续更多的考察研究可丰富该物种的生物学资料。

致谢：本研究得到了以下项目支持：云南省基础研究计划（专项）优秀青年项目（202001 AW070016），云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目（202005AC160046），中国科协青年人才托举工程（2019−2021QNRC001），生态环境部生物多样性调查、观测和评估项目（2019—2023 年），第二次青藏高原综合科学考察研究（2019QZKK0501）。感谢西南林业大学吴东益、贺艳红和黄佳玥同学在分子实验及鉴定方面给予的帮助。