吕维志

（北京市大兴区中西医结合医院口腔科 北京 100067）

牙菌斑中的微生物是引起慢性牙周炎的始动因子，首先引起牙龈出血，牙龈的炎症，进而引起牙周支持组织的感染性炎症的一类疾病，严重的牙周炎可以起起较深的牙周袋形成、附着性丧失和牙槽骨质的吸收进一步加重，最后可导致牙松动和牙拔除。牙龈发炎时，由于牙龈的肿胀和增生使牙龈缘的边缘向牙冠方向移动，使牙龈沟加深，但是牙龈结合上皮的位置并没有向根方迁移，为假性牙周袋。而患慢性牙周炎时，牙龈的结合上皮向根方增殖，其冠方牙龈与牙面分离，使龈沟加深而形成牙周袋，这是真性牙周袋。当然，临床上的牙周袋常包含上述两种情况，即牙周袋是由于牙龈缘向冠方移动以及沟底向根方延伸所形成的。牙周袋内含有菌斑、牙石、龈沟液、唾液粘蛋白、脱落上皮和白细胞等。慢性牙周炎是临床最常见的疾病之一，它的发生机制是由于宿主的免疫防御机制与微生物之间的相互作用造成的。这种相互作用通过炎性因子所介导，而其中MAPK 信号通路在介导炎性因子发生、发展中起到很重要的作用。

MAPK，是把信号从细胞表面传递到细胞核内部的重要途径之一。丝裂原活化蛋白激酶的简称，是一组能被细胞外的各种刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。 MAPK 信号转导通路存在于所有真核细胞内，这一通路将细胞外刺激信号转导至细胞核内，介导炎性因子的产生，参与细胞增殖、分化、癌变、转移、凋亡等一系列生理过程，具有至关重要的作用。但目前对MAPK 在慢性牙周炎的发病机制中所起的作用观点不一。本研究旨在检测慢性牙周炎患者龈沟液中MAPK 的水平，以及牙周基础治疗对其的影响。

实验试剂与仪器：牙周探针，超声洁治器，超声刮治器，手动刮治器，冲洗注射器，3%过氧化氢溶液，1%碘甘油，吸潮纸尖，电子天平，-70℃低温冰箱，冷冻离心机，隔水式电热恒温培养箱。缓冲液全自动酶标仪：人丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），ELLISA试剂盒。洗板机：加样枪。微型混合器：移液器恒温水浴箱。

1 实验对象

1.1 病例选择

病例中慢性牙周炎的患者20 例，经与患者沟通后，且得到患者同意。对慢性牙周炎患者进行龈沟液的提取，同一患者、同一颗牙齿，选取牙周炎最严重的部位提取，并且记录好该部位，经牙周基础后，也要从相同的部位提取龈沟液，以便于对照。牙周健康者20 例。

1.2 纳入标准

对照健康者：GI≤1，AL=0mm，PD≤3mm；慢性牙周炎组：GI＞1，AL≥3mm，PD≥4mm。

1.3 排除标准

有吸烟史、系统性疾病者，如糖尿病、风湿性关节炎、炎性肠病、肺部疾病、多发性硬化、肥胖、细菌、病毒和真菌系统感染者；3 个月内用过大量抗生素、糖皮质激素、非甾类抗炎药免疫调节剂或避孕药者；女性妊娠及哺乳期等。

1.4 实验设计

首先筛选出符合纳入标准的患者，然后进行全口牙周检查，记录牙周各项指标，拍摄全口曲面断层片。提取待测牙的龈沟液。经过牙周基础治疗后，用双氧水冲洗牙周，牙周内放碘甘油，口腔卫生宣教。然后6～8 周定期复查，再次在同一位点提取龈沟液，治疗第12 周后拍片。所有牙周基础治疗、检测记录及液体样本的采集均应由同一医师完成,排除误差。

1.5 实验分组

组1：20 例牙周健康对照者。

组2：20 例慢性牙周炎患者。

组3：组2 中20 例慢性牙周炎患者进行牙周基础治疗后（龈上洁治及龈下刮治）。

2 龈沟液样本的采集和保存方法

2.1 各组提取龈沟液的要求

组1 要确保足够的量，GCF 从没有炎症的多位点收集。

组2 提取龈沟液的部位是口腔中牙周炎最严重的位点（附着丧失最严重的位点）。

组3 提取龈沟液的部位与组2 相同且在治疗后6～8 周收集。

2.2 EP 管准备

0.5mlEP 管经过高温高压消毒后，吸潮纸尖也要经过物理（紫外线）消毒，把吸潮纸尖的尖端剪掉，装在一个EP 管中，在电子天平上称重并记录。称重后的重量减去收集龈沟液前记录的重量，按比重换算成龈沟液的体积。

2.3 待测牙准备

三用气枪吹干待测牙面和周围牙龈黏膜约10秒，然后用棉球隔湿，此过程一直保持干燥，不能有水。

2.4 标本取样

将消过毒的吸潮纸尖轻缓慢慢放入待测牙的B侧和L 侧的近中、中央、远中6 个点位，遇到阻力即停止，在每个点位约停留30s 后取出，马上将吸潮纸尖放入EP 管内，如果取龈沟液时，吸潮纸尖带血、食物残渣、上皮坏死脱落组织等，则丢之不用，再重新取。

2.5 保存样本

超低温冰箱保存备用。

3 龈沟液中MAPK 的检测

3.1 检测方法

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对龈沟液中MAPK 水平进行测量。ELISA 法定量可测定人血清、血浆、细胞培养血清或其它相关的生物液体中的MAPK 含量。

3.2 操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时均需混匀，混匀时尽量避免起泡，每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

4 结果

4.1MAPK 的浓度

患有牙周炎组，治疗前龈沟液中MAPK 的平均水平是：191.68pg/ml；治疗后龈沟液中MAPK 的平均水平是148.85pg/ml；健康对照组中MAPK 的平均水平是：139.40pg/ml。牙周炎治疗前MAPK 明显高于治疗后，治疗前牙周炎组MAPK 明显高于健康对照组MAPK，治疗后牙周炎组MAPK 与健康对照组无明显差异，说明牙周炎通过牙周基础治疗后，龈沟液中MAPK 的浓度明显下降了。

Tab1 健康对照牙龈龈沟液中和慢性牙周炎治疗前MAPK 的比较

Tab2 慢性牙周炎治疗前和治疗后牙龈龈沟液中MAPK 的比较

Tab3 健康对照牙龈龈沟液中和慢性牙周炎治疗后MAPK 的比较

4.2 临床指标的变化

牙周炎组治疗前，GI、PD、AL、BI 均明显高于健康对照组，治疗后的GI、PD、AL、BI 又明显低于治疗前，从侧面也证实了经过牙周治疗后，牙周炎的牙周情况已经明显改善了。

Tab4 牙周炎组治疗前和健康对照组临床指标比较

Tab5 牙周炎组治疗前和治疗后临床指标比较

5 讨论

牙周炎是多因素参与的疾病，宿主对细菌挑战的免疫应答反应是决定牙周炎是否发生，以及病情的轻重、范围的大小、发展速度的快慢等必要因素之一。全身性疾患也可以对牙周炎有消极影响，如慢性糖尿病、Down 综合征和白细胞异常功能等。再或者有一些环境和行为因素也将是危险因素，譬如精神压力和吸烟。为了了解影响牙周炎的因素，近年来不少人致力于牙周炎的研究。本实验，牙周炎的进程，影响龈沟液中MAPK 的表达，从而成为确诊牙周炎的指标之一。

6 结论

6.1 慢性牙周炎经基础治疗后，临床指标（GI、BI、PD、AL）都有显著的变化，从侧面证明牙周基础治疗是治疗牙周疾病的方法之一。

6.2 牙周炎组的龈沟液中可以检测到MAPK，并且浓度水平明显高于健康对照组，说明MAPK 可能与牙周炎存在一定的正相关。

6.3 经治疗后，MAPK 的浓度水平明显低于治疗前。再次一次证明，牙周炎病情的严重程度影响着MAPK 的表达水平。

6.4 绝大多数患者经过牙周基础治疗后，依从性较好，基本都按照正确的刷牙法，才能保持良好的口腔卫生，从而为牙周炎后期的维护提供了可靠的保证。

6.5 龈沟液中MAPK 的浓度与探针深度、附着丧失，在统计学上存在正相关关系。