侯 静，黄 勇，黎 理，王素娥，蔡 毅

（广西中医药大学，南宁 530001）

斑地锦（Euphorbia maculataL.）是大戟科（Euphorbiaceae）大戟属（Euphorbia）地锦草组药用植物，有清热解毒、凉血止血、利湿退黄等功效；可用于治疗痢疾、泄泻、尿血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疸等疾病［1］。近年来研究发现，其也具有保肝、治疗宫颈癌、抗肿瘤、抗高血糖、抑制胃癌细胞增殖、抗骨质疏松及抗细胞毒性等药理作用［2-14］。地锦草组植物有10 种［15］，分布在广西的有6 种，其中斑地锦、匍匐大戟（Euphorbia prostrataAit.）、台西地锦［Euphorbia taihsiensis（Chaw et Koutnik）Oudejians.］、千 根 草（Euphorbia thymifoliaL.）这几种较为常见且常常混生，植物形态和药材性状也极为相似［16，17］，这就造成斑地锦鉴别困难，从而无法准确确定其来源。本研究采用DNA 条形码技术对广西产斑地锦及混淆品进行鉴别，有助于提高斑地锦临床用药的准确性，同时为地锦草组植物的鉴别提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器和试剂 仪器：ES2220M 型电子天平（普利赛斯公司），Milli-Q Biocel 型纯水仪（Millipore 公司），DYY-6C 型电泳仪（北京六一生物科技有限 公司），Thermal Cycler-T100 型梯 度PCR 仪（BIORAD 公司），H1650-W 型高速离心机（湘仪公司），GelDoc XR+型全自动凝胶成像系统（BIORAD公司），HWS-24 型电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司），TGem Plus 型超微量分光光度计（天根生化科技（北京）有限公司）。试剂：2×Reaction Mix 缓冲液、D2000 DNA Marker、DNase/RNase-Free Deionized Water（TIAN GEM 公 司）；GelGreen（41003，Biotium）；1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）、6×DNA Loading Buffer（Solarbio）、氯化钠（西陇科学股份有限公司）、琼脂糖（博格林生物）、无水乙醇、异丙醇、氯仿（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、CTAB（美仑生物科技有限公司）。

1.1.2 样品 采自广西壮族自治区的斑地锦及其混淆品样品共41 份，经鉴定为大戟科大戟属斑地锦、匍匐大戟、台西地锦及千根草，样品具体信息如表1所示。

表1 斑地锦及其混淆品的样品信息

1.2 试验方法

1.2.1 提取DNA 取100 mg 斑地锦及混淆品样品地上部分置于研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将其转入已灭菌的2 mL 离心管中，加入750 μL 预热的DNA 提取缓冲液［2% CTAB，2% β 巯基乙醇，100 nmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20 nmol/L EDTA（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，2% PVPK 40］摇匀。65 ℃水浴1 h，每隔10 min 振荡1 次。取出后加入预冷的650 μL 氯仿-异戊醇（24∶1）振荡摇匀，1 200 r/min，离心10 min后取上清液转入1.5 mL 灭菌离心管中，加入2/3 体积预冷的异丙醇，上下颠倒摇匀。于-20 ℃下沉淀1～2 h，1 200 r/min，离心5 min 后去废液。750 μL 无水乙醇洗2 次，自然风干。加入50～80 μL TE 缓冲液溶解DNA，-20 ℃条件下保存。

1.2.2 PCR 扩增及测序 PCR 反应体系为25 μL，其 中2×Reaction Mix 12.5 μL，Golden DNA Polymerase 0.2 μL，模板DNA 2 μL，正向反向引物各1 μL，灭菌ddH2O 8.3 μL。rbcL 和psbA-trnH 引物均由睿博兴科生物技术有限公司合成（表2）。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，退火1 min（rbcL 退火温度为52 ℃，psbA-trnH 为51 ℃），72 ℃延伸1 min，35 次循环，末次循环后72 ℃延伸5 min。将获得的单一明亮条带的PCR 产物送至广州华大基因公司进行双向测序。

表2 rbcL 和psbA-trnH 引物

1.2.3 数据处理 利用GenBank 数据库Blast 检测所测序列的准确性和方向性，利用BioEdit 对序列进行人工校正［18］，去除引物片段。此外，从GenBank 获取了13 份斑地锦及其混淆品的rbcL 和psbA-trnH序列用于后续的分析（表3）。利用MEGA 7.0 对所有材料rbcL 和psbA-trnH 序列的变异位点进行分析［19］，基于K2P 模型计算种内和种间遗传距离，利用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建斑地锦及混淆品的系统发育树，利用bootstrap（1 000 次重复）检验各分支的支持率。

表3 斑地锦及其混淆品样品GenBank 序列号

2 结果与分析

2.1 rbcL 和psbA-trnH 序列特征

由表4 可知，所有品种的rbcL 序列长度均为548 bp，其中斑地锦种内存在3 个变异位点，斑地锦与匍匐大戟、台西地锦、千根草的种间变异位点分别为5、5、4个；除土库曼大戟外（不含psbA-trnH序列），其他品种的psbA-trnH 序列长度均为631 bp，斑地锦种内存在2 个变异位点，斑地锦与匍匐大戟、台西地锦、千根草种间变异位点分别为13、17、14 个。

表4 斑地锦及其混淆品样品的rbcL 和psbA-trnH 序列分析

2.2 种内及种间遗传距离

通过MEGA7.0 软件，基于K2P 模型对斑地锦样品及其混淆品的种内和种间遗传距离进行计算，结果见表5、表6。基于rbcL 序列分析的结果可以发现，斑地锦种内遗传距离为0.000，明显小于其与各个混淆品间的遗传距离，其与台西地锦的种间遗传距离最大，为0.007；匍根大戟与土库曼大戟以及与台西地锦间的遗传距离均为0.000。基于psbA-trnH遗传距离分析结果可以发现，斑地锦与匍匐大戟、台西地锦、千根草、地锦草、匍根大戟的种间遗传距离分别为0.012、0.016、0.013、0.014、0.012。

表5 斑地锦与其混淆品样品rbcL 序列的遗传距离

表6 斑地锦与其混淆品样品psbA-trnH 序列的遗传距离

2.3 系统发育树分析

以蓖麻（BM）作为外群，基于K2P 模型构建了斑地锦和混淆品样品的rbcL 和psbA-trnH 序列系统发育树，结果如图1 所示。在系统发育树中，斑地锦样品及其混淆品各自形成单系且均有较高支持率，这表明rbcL 和psbA-trnH 序列均可用于斑地锦与其常见的混淆品鉴别。

图1 斑地锦及混淆品的NJ 树

3 小结与讨论

在本研究中，基于rbcL 序列分析发现，匍根大戟和台西地锦的种内及种间遗传距离均为0.000，该基因片段无法将两者区分开；基于psbA-trnH 序列发现两者之间遗传距离为0.003，可进行有效区分；在系统发育树中，这2 种样品形成一个大的分支，支持率为96%，表明两者间亲缘关系较近。rbcL、psbA-trnH 这2 个序列无法将同一品种不同来源的样品进行区分，但基于rbcL 序列分析发现，采集于柳州市的斑地锦的种内遗传距离为0.001，而采集于南宁市和桂林市的斑地锦种内遗传距离均为0.000，表明来源于柳州市的斑地锦种内差异较大。

DNA 条形码技术有种属保守性，又有近缘物种的特异性［20，21］，线粒体psbA-trnH 序列是被子植物叶绿体基因组中变异位点最多的序列之一［22，23］，在药材鉴定中有着较广泛的应用，具有较好的植物种间鉴别作用。rbcL 可单独或与其他基因片段组合用于植物种群的鉴定、分类等研究［24］。高节点支持率能在物种鉴定和计量系统发育多样性时提供无偏差的估计，并获得较为可信的结果［25，26］。本研究发现，rbcL 与psbA-trnH 组合构建的NJ 系统发育树具有高节点支持率，分支聚类结果可信，可用于斑地锦与其常见混淆品的鉴别。仅使用叶绿体基因片段或核基因片段鉴定物种，鉴别成功率往往较低，而将基因片段进行组合构建系统发育树则有利于提高物种DNA 条形码鉴定效果［27］。