刘潮 韩利红 盛巧 陶雾

摘要：类甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLP）被归为病程相关蛋白第5家族，在植物防御和生长发育过程中发挥作用。使用Mega X、CodonW及EMBOSS网站在线软件，分析8种植物（莱茵衣藻、小立碗藓、拟南芥、水稻、谷子、高粱、小麦、玉米）类甜蛋白家族进化和密码子使用偏性。结果表明，植物类甜蛋白主要归为10个聚类组，其中聚类组Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ中的TLP数目相对较多;5种禾本科作物TLP家族基因主要以G和C作为第3位密码子，密码子具有较强的偏好性，多数类甜蛋白基因ENC值较小，GC3s值分布较集中;8个最优密码子第3位均为G或C结尾，禾本科植物类甜蛋白家族基因密码子偏好G/C结尾。本研究分析了8种植物中类甜蛋白家族基因的进化特征及密码子使用偏性，为该家族基因的分子进化以及转基因应用提供了理论依据。

关键词：类甜蛋白;系统进化;密码子偏性;最优密码子

中图分类号： S188  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）10-0044-08

类甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLP）属于病程相关蛋白第5（pathogenesis-related protein，PR5）家族，因与产自西非的翅果竹芋（Thaumatococcus danielli）的甜蛋白（thaumatin）氨基酸序列相似度较高而得名。TLP广泛存在于多种动植物和微生物中[1-3]。研究发现，TLP具有抗真菌和渗透调节活性等，或作为其他抗真菌蛋白的激发子[4-7]，在植物的生长发育和抗逆过程中发挥重要作用[8-10]。不同物种基因组中密码子的使用频率不同，这种密码子非均衡使用的普遍现象称为密码子使用偏性（codon usage bias）[11]。同义密码子的选择性使用提高了翻译的准确性和效率，生活在相似环境条件下的物种具有相似的密码子偏好，能够生活在多种生境中的生物，翻译效率降低，密码子使用偏性对基因的表达起重要的调节作用[12]。密码子使用偏性分析对于基因表达预测、异源表达最适宿主选择和密码子优化均具有重要意义[13]。不同植物物种编码TLP数量有很大差异，如胡萝卜（Daucus carota）和黄瓜（Cucumis sativus）等蔬菜中有约30个，水稻（Oryza sativa）和谷子（Setaria italica）等作物中多于50个[14]。植物基因组中TLP基因数量除了与基因组大小有关外，植物在进化过程中所处的环境也对TLP数量有重要影响，当植物面临较大的环境胁迫压力时，对抗环境胁迫的相关基因通过基因间和基因内重组，导致了基因数目的增加，从而使植物发生了快速的适应性进化[15]，如RLK家族近期的扩张与植物防御/抗病基因有关[16]。密码子偏性主要受突变压力[17]和自然选择压力影响[9]。突变—选择—漂变平衡假说认为，突变的发生具有方向性，突变—选择平衡导致持续进化的种群具有稳态适应性突变[18]。通过基因工程等手段对基因密码子进行有目的的改造，能大大提高外源基因在宿主中的表达水平[19]，因此密码子偏性的研究对基因工程具有重要的应用价值。

随着现代分子生物学的发展，人类已进入了后基因组时代，大量植物基因组数据的公布为研究植物基因家族进化提供了可能。植物TLP家族在植物的生长发育和抵御环境胁迫中发挥了重要作用，然而，目前对不同物种中该家族基因的进化和密码子偏性研究鲜见报道。本研究从蛋白氨基酸和基因的碱基组成出发，从不同类群的物种中选择莱茵衣藻、小立碗藓、拟南芥、玉米、水稻、小麦、高粱和谷子进行TLP家族进化、编码序列（coding sequence，CDS）密码子的组成及使用偏性分析，为TLP家族基因的开发利用和优良抗性作物品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 基因序列获取与鉴定

2021年1月通过Superfamily网站（http：//supfam.org/SUPERFAMILY）和基因组序列数据库（http：//plants.ensembl.org/index.html）以thaumatin为关键词搜索数据库，获得并下载莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（O. sativa）、谷子（S. italica）、高粱（Sorghum bicolor）、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）中TLP家族蛋白及CDS序列，使用SMART数据库对蛋白功能域进行确认，去掉不含类甜蛋白结构域的序列。

1.2 基因家族进化分析

所有蛋白通过Clustal X比对，应用Mega X构建邻接（neighbor-joining，NJ）系统发生树。NJ进化树采用泊松校验，分析步长值为1 000。

1.3 基因同义密码子偏性分析

1.3.1 密码子组成和使用特性分析

使用CodonW软件分析基因CDS密码子使用偏性，分析参数：同义密码子在第3位上相应碱基的出现频率（A3s、G3s、C3s、T3s）、密码子适应指数（codon adaptation index，CAI）、有效密码子数（effective number of codon，ENC）、密码子第3位的G+C含量（GC3s）和基因的G+C含量（GC）等。通過EMBOSS在线软件对TLP家族基因同义密码子相对使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）进行分析。使用统计软件SPSS 23.0对密码子组成和使用偏性各参数进行相关性分析。

1.3.2 ENC-plot绘图分析

分别以GC3s和ENC为横纵坐标，绘制ENC-plot，检测碱基组成对密码子偏性的影响[20]。图中曲线表示密码子偏性仅受碱基影响时的ENC预期值，此时ENC计算公式为ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]，靠近标准曲线表示密码子偏性主要受碱基突变影响，远离标准曲线表示密码子偏性主要受自然选择影响。

1.3.3 最优密码子确定

选择ENC值前后各10%作为低表达和高表达基因，分别计算2组基因中TLP基因密码子的RSCU值。ΔRSCU=高表达组RSCU-低表达组RSCU，当ΔRSCU>0.3，且在高表达组中RSCU>1，在低表达组中RSCU<1，可确定该密码子为最优密码子（optimal codon）[3，21]。

2 结果与分析

2.1 TLP家族基因数量分析

通过搜索Superfamily数据库，鉴定到植物TLP蛋白数量分别为莱茵衣藻1个、小立碗藓5个、拟南芥24个、水稻41个、谷子47个、高粱46个、小麦138个、玉米47个。植物TLP数量与基因组大小呈正相关，随基因组的增大，TLP数目增加。因小麦为六倍体，其基因组较大，染色体数目较多，单位Mb染色体上的TLP蛋白较少，只有0.010 3个。虽然拟南芥中总TLP数目只有24个，但因其基因组相对较小，且染色体只有10条，单位Mb染色体上的TLP蛋白数量最多，达到0.196 9个。水稻、高粱和谷子中的染色体数目比较接近，其TLP蛋白数量也相差不是很大。

2.2 TLP家族进化分析

使用MEGA 5.0软件通过蛋白序列对8种植物TLP家族成员进行进化分析。参考前人研究[1，15]将植物TLP家族蛋白归为10个聚类组（图1）。分析发现，水稻、谷子、小麦和玉米在全部10个聚类组中均有成员分布，高粱在除聚类组Ⅹ外的聚类组中均有成员分布，拟南芥在聚类组Ⅲ和Ⅹ中没有成员分布（表1）。研究发现，各植物TLP在10个聚类组中分布很不均衡，聚类组Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ各组中的TLP数目相对较多，其中水稻、谷子、高粱、小麦、玉米5种作物聚类组Ⅴ中的成员均明显较多，说明这些聚类组中的基因出现了特异性的基因扩张。聚类组Ⅴ中的OsTLP基因数量最多，该组中的一些TLPs能响应病原或环境胁迫[16]，说明这些基因可能与植物对抗胁迫有关，有待深入研究。

2.3 TLP家族密码子偏性分析

2.3.1 8种植物TLP家族基因密码子使用参数分析

为全面了解植物TLP家族基因密码子使用性，对8种植物的同义密码子在第3位上相应碱基的出现频率、CAI、ENC、GC3s等参数进行分析（表2）。分析密码子第3位的核苷酸发现，小立碗藓和拟南芥对A、T、C、G 4种核苷酸的使用比例相当，第3位密码子偏性不是很明显，但5种禾本科作物种C3s和G3s数值明显高于T3s和A3s，主要以C和G作为第3位密码子， 其中以C作为第3位密码子的概率比G要高一些。8种植物TLP家族基因GC含量也不相同，拟南芥TLP家族基因GC含量为49.8%，小立碗藓为53.8%，而5种禾本科作物均不低于66%。各物种中GC3s与GC含量类似，5种禾本科作物中均较高，且均高于82%，水稻中甚至达到88.5%。

CAI用于衡量基因与高表达基因密码子使用的接近程度，该值越高表示基因表达水平越高，反之，表达水平越低。拟南芥和小立碗藓TLP家族基因CAI值分别为25.2%和26.3%，莱茵衣藻的TLP家族基因CAI值为33.5%，5种禾本科作物TLP家族基因CAI值均不低于27.4%，高粱TLP家族基因CAI值高达29.6%。ENC值反映基因编码对密码子选择性强弱[18]，ENC值越小表示该基因表达潜力越高，基因对密码子的使用偏性越强[20]。小立碗藓和拟南芥TLP家族95%的基因ENC值均高于50，说明其TLP家族基因密码子使用偏性较弱，多数属于低表达基因，而水稻、谷子、高粱、小麦和玉米TLP家族95%的基因ENC值均介于33～40之间，平均值介于35～39之间，说明这些TLP基因密码子使用偏性较强，具有较高的表达潜力，可能在植物生长或抵御逆境过程中发挥作用。

2.3.2 有效密码子数与同义密码子第3位GC含量关联分析

GC3s分布反映了植物所受的选择压力，GC3s分布越分散，代表密码子使用偏性主要受碱基突变压力影响，GC3s分布越集中，代表密码子使用偏性主要受自然选择压力影响[3，22]。ENC-GC3s关联分析中，基因分布越靠近标准曲线，表示密码子使用偏性受到较小的自然选择压力影响，反之表示基因受到选择压力或其他因素的影响越大[23]。莱茵衣藻只有1个TLP基因，其ENC值为37.51，GC3s值为86.3%（图2），与本研究中其他植物大部分基因集中在同一位置。小立碗藓有5个TLP基因，其中3个分布位置非常接近标准曲线（图2），说明在小立碗藓中TLP基因受自然选择压力影响较小。拟南芥基因分布于标准曲线下方，但GC3s分布较广泛（图2），说明拟南芥TLP基因受到突变选择和自然选择的双重影响。值得注意的是，水稻、小麦、高粱、谷子、玉米几种主要作物中大多数TLP基因ENC值较小，GC3s值分布较集中，且位于标准曲线下方，说明这些物种中TLP基因主要受到自然选择压力的影响。

2.3.3 类甜蛋白家族基因同义密码子相对使用度分析

若RSCU>1，密码子出现的频率比其他同义密码子高，反之，出现频率低。TLP基因RSCU值分析表明，不同植物物种氨基酸密码子RSCU值不同，5种单子叶禾本科作物RSCU值一致性较高，TLP家族基因25个RSCU>1的氨基酸密码子均以G或C结尾，拟南芥作为双子叶植物的代表与单子叶植物密码子RSCU值趋势多數截然相反（表3）。如编码丙氨酸的密码子，拟南芥偏好GCT，而其他7种植物偏好GCG或GCC;编码半胱氨酸的密码子，拟南芥偏好TGT，而其他7种植物偏好TGC。

2.3.4 最优密码子分析

通过对高表达和低表达组密码子RSCU值进行比较，发现8个最优密码子分别编码丙氨酸（Ala，GCG）、谷氨酸（Gly，GGG）、组氨酸（His，CAC）、脯胺酸（Pro，CCC和CCG）、精氨酸（Arg，CGG）、 色氨酸（Ser，TCG）、 苏氨酸（Thr，ACG）（表3）。其中6个密码子第3位为G，2个密码子为C，表明所分析的植物，尤其禾本科作物优先使用G或C结尾的密码子。

3 讨论

类甜蛋白在植物的发育和对抗胁迫过程中发挥作用[7-8，24-25]，该家族基因数目的多少除了与基因组大小有关外，植物面临的环境胁迫压力往往也影响了基因的扩张[1]。本研究中莱茵衣藻和小立碗藓编码了相对更少量的TLP家族基因，其次是小麥和玉米，而小麦的基因组在进化过程中均曾多次发生染色体加倍现象[26]，玉米很可能是一种异源四倍体起源的生物[27]。生物的生存策略有2种，一种是通过快速增加个体，从而提高下一代的个体数量，另一种是通过发展抵抗胁迫的防御系统，提高单个个体的存活概率。植物TLP家族基因在植物的防御反应中发挥作用，而一些禾本科作物可能通过增加TLP家族基因数目增强防御能力，提高后代存活概率，因此含有较多的TLP家族基因。

在长期的进化过程中，为了适应环境和应对胁迫，植物对编码特定蛋白氨基酸的密码子使用出现偏性，使用频率最高的密码子称为最优密码子[28]。

8种植物TLP家族基因密码子使用偏性有很大不同。拟南芥和小立碗藓TLP家族基因GC含量和GC3s值相对较低，而5种禾本科作物这2类参数均较高。5种禾本科作物主要以G或C作为第3位密码子首选。双子叶植物偏爱A/T结尾的密码子，单子叶植物偏爱G/C结尾的密码子[22，29]，较高的GC3s值表示基因表达受DNA甲基化或基因改变影响，加速了基因的进化[30]。本研究结果与前人研究一致，禾本科植物TLP家族基因偏爱GC结尾的密码子，可能是因为单、双子叶植物受植物早期进化选择影响，TLP家族基因密码子使用偏性具有种属特异性。禾本科作物基因GC含量和GC3s影响了基因密码子的偏性，高表达基因偏爱使用G/C结尾的密码子，是选择性驱动了密码子的偏性[31]。本研究通过ΔRSCU法共鉴定了8个最优密码子，其中6个密码子以G结尾，2个以C结尾，这可能与8种植物TLP家族基因较高的GC含量有一定关系[32]。但在其他植物的某些基因中也有相反的结果，如在小麦[23]、水稻[33]和玉米[34]中，基因组GC含量较高，最优密码子中富含AT。基因密码子偏性参数ENC、RSCU和最优密码子分析均表明，5种禾本科作物TLP基因偏好G/C结尾的密码子。ENC与GC3s关联分析发现，小立碗藓TLP家族基因受正向选择压力较小，拟南芥受到突变和正向选择压力双重影响，而5种禾本科植物TLP家族基因密码子具有较高的GC3s值，并远离标准曲线，主要受正向选择压力影响，进一步说明正向选择作用在禾本科作物TLP家族基因进化过程中发挥了显著作用。由于密码子偏性对基因的表达有较大影响，因此开展基因异源表达研究时，须要结合密码子偏性进行设计，否则可能无法获得准确的表达量信息，甚至影响表达产物的获得。

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