张娴莹

关键词：微生物;发酵工程;发展趋势

微生物是肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称[1]，包括细菌、真菌、放线菌、支原体和衣原体等[2]。微生物氧化分解有机物质和释放能量的过程称为生物氧化，生物氧化分为呼吸和发酵两种，发酵是生物氧化的重要途径。发酵是指各类微生物细胞分解有机物的过程，或者是指通过微生物技术和离体的酶分解糖类，产生大量乳酸、乙醇和二氧化碳等代谢反应产物的过程。

生物工程又称生物技术，是以生物学（特别是微生物学、遗传学、生物化学和细胞生物学）为基础[3]，结合化学、机械、电子、計算机等现代工程技术，利用生物体的特性和功能，运用分子生物学的新技术，有意识地操纵遗传物质，对生物体及其功能进行定向修饰，然后通过适当的生物反应器大规模培养这些工程细菌或工程细胞系，产生大量有用的代谢物或发挥其独特生理功能的一个综合性技术体系，是在分子生物学和细胞生物学基础上发展起来的一门新型综合性应用学科。它以分子生物学、仿生学等现代科学为指导，在工程领域应用各种生物利用技术和生物模拟技术，包括基因工程（基因工程）、细胞工程、微生物工程（发酵工程）、酶工程（生化工程）和生物反应器工程。

1发酵工程概述

1.1发酵工程的概念

微生物工程又称发酵工程，是生物工程的一个重要组成部分，即利用微生物，在适当的条件下，将原料通过特定的代谢途径加工成人类所需要的产品。从广义上讲，发酵系统工程由3个部分组成：上游工程、中游工程和下游工程。上游工程是理论研究、技术发展，包括优良菌株的选育、最佳发酵条件（pH、温度、溶解氧和营养成分）的确定等。中游工程主要是指在最佳发酵条件下进行细胞大量培养和发酵罐中代谢产物生产的技术。下游工程指从发酵液中分离和纯化进行生产的技术，包括固液分离分析技术（例如离心分离、过滤分离、沉淀分离等工艺）、细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）、蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），还有产品的包装设计处理技术（真空干燥和冰冻干燥等）。从微生物的选择、营养条件的确定、灭菌、种子罐膨胀培养、接种、发酵后期产品的分离纯化等方面，对社会经济的发展起到了很大的促进作用。

发酵工程技术发展历史悠久，经历了“手工农产品加工—近代发酵工程—现代发酵工程”3个阶段[5]，可以利用现代生物信息技术对微生物进行质的改造，或构建出微生物原来不具有的新性状的菌株，利用微生物生长速度快、生长环境条件比较简单以及代谢过程简单等特点，在合适的条件下通过现代化建设工程管理技术和方法，使传统的劳动密集型微生物产业向技术密集型产业不断发展，形成众多生物系统工程新型文化产业，开发众多人类社会需要的微生物发酵工程产物。

1.2发酵工程的类型

1.2.1对氧的需求

按照对氧的需求，发酵工程分为好氧发酵和厌氧发酵。好氧发酵也叫通风发酵，是指在发酵过程中必须通风提供氧气的发酵过程，一般工业生产中采用通入一定量无菌空气的方法实现。厌氧发酵是指在整个发酵过程中无需通风提供氧气的发酵过程，一般厌氧发酵过程需要密闭容器。

1.2.2培养基的物理状态

按照培养基的物理状态，发酵工程分为固态发酵和液态发酵。固态发酵是指微生物接种于固态培养介质中的发酵过程。液态发酵是指微生物接种于液态培养介质中的发酵过程。

1.2.3菌种多样性

按照菌种多样性，发酵工程分为纯种发酵和混菌发酵。纯种发酵是指接种单一纯种微生物进行培养的发酵过程。混菌发酵是指接种多种微生物进行培养的发酵过程。

1.2.4工艺流程

按照工艺流程，发酵工程分为分批发酵、连续发酵和补料分批发酵。分批发酵是一种在特定条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法[6]。连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内连续输入一种新鲜培养基料液，同时以相同速度不断流出含有产品的发酵液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵生产过程[7]。补料分批发酵是指在分批培养过程中，间歇或连续补充新鲜培养液的培养方法。

1.2.5发酵规模

按照发酵规模，发酵工程分为小试发酵、中试发酵和大生产发酵。小试发酵是指在实验室小试规模下进行的发酵过程，一般反应器容积在10～100L。中试发酵是指规模介于实验室小试发酵和大生产发酵之间的发酵过程，一般反应器容积在100～3000L。大生产发酵是指在工业生产规模下进行的发酵过程，一般反应器容积在3000L以上。

1.2.6发酵原料

按照发酵原料，发酵工程分为糖类发酵、油类发酵、废水发酵等类型。

1.2.7发酵产物

按照发酵产物，发酵工程分为氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等[8]。

1.2.8代谢产物

按照代谢产物，发酵工程分为初级代谢产物发酵（酒精发酵、氨基酸发酵、有机酸发酵等）、次级代谢产物发酵（抗生素发酵、色素发酵等）。初级代谢产物是指微生物通过代谢活动产生的初级代谢物，是生长和繁殖必需的物质;次级代谢产物是指生物生长到一定阶段，通过次级代谢合成的分子结构非常复杂的次级代谢物，没有明显或没有必要的生物小分子的生长和繁殖。

1.3发酵工程发展史

发酵→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗生素发酵工业→氨基酸、核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物。

1.3.1发酵现象的早期认识

1857年，巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵形成的[8]。

1897年，毕希纳发现磨碎的酵母仍能使糖发酵形成酒精酶[8]。

1.3.2发酵工程的早期阶段F3D9B4C2-B8AC-449F-9694-5068F248BE2D

人们对发酵工程技术的认识始于19世纪末期，主要来自厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产食用酒精、乳酸和各种不同发酵过程的食品[8]。

1916年，英国用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇;第一次世界大战期间，德国用亚硫酸盐法生产甘油，标志着发酵工程从食品工业拓展到非食品工业[8]。

1.3.3发酵工程的重大转折点

1940年初，二战爆发，青霉素被发现，工业化大规模生产迅速形成。随着抗生素工业的发展，形成了一套系统完整的好氧发酵生产技术，推动了全世界发酵工业的深入发展，为现代发酵工程建设奠定了基础[8]。

1970年初，细胞融合技术、基因技术等生物技术的发展[9]，打破了生物物种之间的障碍，引导了新的有用微生物的生产，增加了控制微生物代谢物的基因拷贝，可以大大增加目标产品的产量。将动物、植物或某些微生物的控制基因植入细胞，可以快速、经济地大量生产这些产物。将具有不同工作性能的多种质粒植入微生物体内，使新菌株在清除污染、以非食品物质为原料进行发酵生产或环境信息保护方面发挥作用。

1.3.4发酵工程产业化发展目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年7%～8%的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术为社会生产力的提高带来了巨大的动力，关系到解决食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题[9]。

2发酵工程原理与技术

2.1微生物菌种的选育一般工业微生物可以通过以下方式获得：从菌种保存机构获得相关菌株、筛选所需菌株、从自然样品中分离和筛选菌株、从一些发酵制品中分离目的菌株。

2.1.1自然选育

自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种[10]。

根据研究目的，从自然界中分离、筛选不同菌株的一般方法步骤：样本数据采集→标本材料的预处理→富集能力培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏[11]。

2.1.2诱变育种

诱变育种是利用物理诱变剂和化学诱变剂改变微生物DNA的碱基，使错误的DNA模板形成异常的遗传信息，使某些蛋白质的结构发生改变，改变细胞功能[12]。

2.1.3杂交育种

杂交育种一般是指人工利用真核微生物的有性或准有性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导等，诱导两个具有不同遗传性状的菌株进行基因重组，以获得性能优良的生产菌株。

2.1.4代谢调控育种

代谢调控育种的研究内容主要包括改变代谢通路的育种、改变自我代谢调节系统的育种。

2.1.5原生质体融合技术

原生质体融合技术是将具有不同遗传特性的两个细胞的原生质体融合产生重组的一种人工方法，也称为“细胞融合”。原生质体融合技术在细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的育种中得到了广泛的应用。原生质体融合技术研究的主要工作步骤包括选择优秀菌株、制备原生质体、融合原生质体、融合体再生、筛选优良性状的融合重组子基因。

2.1.6基因工程育种

某些物质在微生物体内是不能合成的，因为它们缺乏合成这些物质的基因或酶。随着基因工程的发展，某种基因可以人工合成，也可以从动物身上提取、加工、拼接，然后通过载体转移到微生物中表达，微生物可以合成人工胰岛素等物质，这些微生物被称为工程菌株。基因工程技术育种主要可以通过学习转化、转导、转染、杂交等手段，有目的地不断增加、增强、取消、减弱某个或某些基因，得到发展需要的工程菌株。

2.2微生物种子扩大培养

2.2.1种子扩大培养

种子扩大培养是将沙管、休眠状态的冷冻干燥管等贮藏细菌活化后接入试管的倾斜面，然后通过锥形瓶和种子罐，经连续扩增后进行一定数量和质量的纯种培养过程。

种子制备包括实验室种子制备和生产车间种子制备两个阶段[13]。

2.2.2影响质量的主要因素

影响质量的主要因素有培养基、接种龄和接种量、温度、pH、通气与搅拌、泡沫等。

2.2.3种子质量标准

种子质量的评价通常从细胞或菌体的形态、发酵工业生产原料可选择化指标、产物生成量、酶活力等方面进行。

3发酵工程常用发酵设备

生物反應器是用于生化反应的核心设备，为生化反应提供合适的场所和反应条件。生物反应器的选择、先进程度、运行操作和管理水平直接影响产品的产量、质量和工业效益。

微生物按需氧量可分为好氧微生物和厌氧微生物，生物反应器也可分为通风生物反应器（好氧生物反应器）和厌氧生物反应器。

3.1通风液体发酵设备

通风搅拌通常是为了提高通风发酵罐中氧气的溶解率，以满足不同微生物代谢和产物不断积累的需要[14]。发酵罐有机械搅拌发酵罐、自吸式发酵罐、气升式发酵罐、喷射自吸式发酵罐、溢流喷射自吸式发酵罐等。

3.2通风固体发酵设备

通风固体发酵是一种设备简单、投资少的传统发酵工艺，广泛应用于酱油和葡萄酒酿造、农副产品生产饲料蛋白等。通风固体发酵设备分为自然通风固体发酵技术设备和工程机械通风固体发酵设备。

3.3厌氧发酵设备

厌氧发酵不需要供氧，设备结构一般比通风发酵简单，发酵设备分为乙醇发酵设备和啤酒发酵设备等。

4发酵过程参数发酵工程技术研究的本质是通过内部控制发酵罐的操作参数，为微生物的生产和积累提供最有利的培养环境[15]。

4.1物理参数

4.1.1温度

温度与酶的反应速率、氧在培养基中的溶解度和转移速率、细胞生长速率与产物合成反应速率密切相关。F3D9B4C2-B8AC-449F-9694-5068F248BE2D

4.1.2压力

罐内的正压可以防止外界空气中的细菌入侵，避免污染，保证纯净的培养环境。

4.1.3空气流量

空气流量是指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也称通风比，是通风发酵的控制参数。

4.1.4搅拌转速

对于通风发酵，通过控制发酵过程不同时期的转速，可以调节培养基中的溶解氧含量。

4.1.5搅拌功率

搅拌功率指搅拌仪器在搅拌时所消耗的功率，通常指混合发酵液每立方米所消耗的功率。

4.1.6黏度黏度

可作为细胞生长或细胞结构形态的一项重要标志，也能反映不同发酵罐中菌丝分裂过程的条件。

4.1.7料液流量

料液流量是控制流体进料的参数。

4.2化学参数

4.2.1pH

发酵液的pH是发酵生产过程中各种反应的综合反映，是发酵工程的重要特征参数。pH与细菌的生长和产物的合成有重要关系。

4.2.2溶解氧浓度

溶解氧浓度是发酵工程的必要条件之一。

4.2.3基质含量

基质含量是指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。

4.2.4浊度

浊度是能及时反映一个单细胞生物生长发展状况的参数，对产品的生产极其重要。

4.2.5产物浓度

产物浓度是确定发酵产品产率或正常合成代谢的重要参数，也是确定发酵时间长短的依据。

4.2.6氧化还原电位

氧化还原电位是发酵工程重要参数之一。

4.2.7废气中的氧和CO₂含量

测定废气中的氧和CO₂含量可以算出生产菌的呼吸熵，得到生产菌的呼吸代谢规律。

4.3生物参数

4.3.1菌丝形态

菌丝形态是评价种子质量、区分发酵阶段、控制发酵代谢变化和确定发酵周期的基础[16]。

4.3.2菌体浓度

菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵[17]。

5微生物发酵工程的应用

现代发酵工程技术已被用于工业、农业、制药、食品、能源、环保等多个行业生产[18]，可以作为一种新兴工业经济体系建设发展，在各个行业创新中发挥重要作用。

5.1医药工业

微生物发酵技术是生物转化的主要方法之一，现代微生物发酵技术与医药研究结合，在医药学领域用于生产抗生素、维生素等常用药物。

5.1.1抗生素的微生物合成

抗生素是由微生物（包括真菌、放线菌、支原体和衣原体等）或高等动植物在生活过程中产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生物细胞生长发育功能的化学物质。

随着现代科学技术的发展，抗生素的来源不仅限于微生物，已扩大到动植物，不仅可以用于治疗细菌感染，还可以用于治疗由原生动物、病毒和立克次体引起的肿瘤等疾病，有些抗生素能促进动植物的生长[19]。

5.1.2维生素类药物的生产

维生素是一系列有机化合物的统称，是生物体需要的微量营养成分，一般无法由生物体自己生产，需要通过饮食等手段获得。作为六大生命要素之一，维生素在生命活动中必不可少。

5.2资源开发

通过生物发酵，可以将绿色植物的秸秆、木屑以及工农业生产中的维生素、半纤维素和木质素等废弃物转化为液体或气体燃料（酒精或沼气）;可以利用微生物采油、产氢以及制成微生物电池;可以用于发展新型生物基化工产品，如水杨酸、乌头酸、丙烯酸、己二酸、丙烯酰胺、长链二元酸、聚乳酸（PLA）和聚羟丁酸（PHB）等。

5.3农业生产

5.3.1生产食用菌

秸秆是水稻、小麦等农作物成熟脱粒后剩余的茎叶部分，其中，水稻的秸秆常被称为稻草、稻藁，小麦的秸秆则被称为麦秆[20]。在适宜的环境下，将秸秆切碎转化为一种良好的食用菌基质，能生产出营养丰富的食用菌。

5.3.2菌糠代替有机肥

食用菌生长后的菌类物质称为菌糠。在纤维素酶的协同作用下，秸秆中的纤维素和半纤维素可以降解为葡萄糖和果糖，动物可以直接利用。特别是饲料中普遍缺乏的必需氨基酸和Ca、Fe、Zn、Mg等元素的含量也相对较高，营养价值很高。可粉碎食用菌糠，直接用作饲料饲养家畜[21]。

随着全世界人口总数的不断增加，人均耕地面积日益减少，粮食及其他食品的需求越来越大，而微生物工程是为人类提供食品、补充营养的重要途径之一，用于微生物蛋白、氨基酸、新糖源、饮料、酒类和一些食品添加剂（如柠檬酸、乳酸、天然色素等）的生产。微生物肥料是一种纯天然、无毒、无害、无残留、无污染的高科技生物，生命力极强，适应社会各类工程地质、各类土壤，使用范围极广，可促进水稻、小麦等作物的生长。

生物有机肥是以动植物残体为主要原料（如食草动物粪便、农作物秸秆等），由特殊功能微生物和有机物组成的肥料。生物有机肥虽然有微生物肥料、微生物菌劑、活性有机肥料等不同的叫法，但都是遵循土壤微生态学和作物营养学的原理，通过固态发酵方法生产的给作物提供营养物质、促进我国经济作物生长的一种复合肥。

6发酵工程发展趋势

6.1发酵原料的开发和利用

粮食和能源紧张问题是当前和未来世界各国面临的挑战。地球上的石油、煤炭、天然气等化石燃料终将枯竭，因此，发酵工业在发酵原料开发和利用方面的发展要求应该是：（1）实现原料到产品的高转化率。（2）开发和利用非粮食农业生物质发酵原料，如纤维素、非粮淀粉、非粮脂肪酸等。（3）加强发酵产业向能源、化工以及材料等领域的延伸，实现部分代替石油，生产大宗材料、能源、化工产品等，逐渐减少对石油的依赖。

6.2提高菌种效率

我国的发酵产业在硬件方面已经达到很高的水平，提高菌种的效率是发展发酵产业的关键。

6.3研发先进的发酵工艺技术

发酵工业具有高耗能、高耗水、不连续、易染菌的缺点，导致发酵产业成本增加，降低了竞争力。未来，发酵产业应该朝着无害高温灭菌、低耗水和连续发酵方向发展，最终达到节能减排的目的。

6.4新型发酵设备的研制

新型发酵设备的研制为发酵工程提供了先进工具，如固定化反应器是利用细胞或酶的固定化技术来生产发酵产品，提高了产率。

6.5大型化、连续化、自动化控制技术的应用

现代生物技术的成功取决于高效率、低能耗的生物反应过程，其高效率又取决于自动化。发酵设备正逐步朝着容积大型化、结构多样化、操作控制自动化的高效生物反应器方向发展，目的在于节省能源、原材料和劳动力，降低发酵产品的生产成本。F3D9B4C2-B8AC-449F-9694-5068F248BE2D