王婧吉，瞿 艳，王 娟，杜坤锐，陈 赟，朱国旗

(1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2.安徽省中医药科学院针灸临床研究所，安徽 合肥 230061；3.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230012)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是第二大常见性痴呆[1]，仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)。据统计，北美与欧洲15%～20%痴呆患者是脑血管病变引起的，而亚洲该类痴呆患者占比30%[2]。VD是由脑血管病变引起，继发神经细胞功能与突触功能的异常[3]。因此，晚期VD患者在脑功能、脑病理变化等方面与AD有较多的相似性[4]，均与海马神经细胞丢失和海马突触可塑性异常密切相关[5]。海马突触结构由突触前膜、间隙和突触后膜组成。突触后膜上分布有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy 5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)以及突触后致密蛋白95(postsynaptic density 95，PSD95)等蛋白，在维系突触后膜结构和发挥功能过程中具有重要的作用[6]。因此，从突触角度探讨VD的发生机制及寻求干预措施具有重要意义。

“百会”“神庭”穴作为督脉腧穴，具有升阳补气、填髓安神之功效，是针灸临床中防治认知功能障碍等神经系统疾病常用选穴。多项研究[7-9]表明，电针“百会”“神庭”可显著改善认知功能障碍患者的临床症状，其作用机制可能与促进血管新生、改善系统性炎症、调控学习记忆相关神经肽物质等相关。然而，电针“百会”“神庭”是否能够影响VD大鼠海马突触结构及具体的机制仍有待进一步探索。本研究选用改良型双侧颈动脉结扎模型[10]，进一步从突触结构与突触蛋白表达水平角度探讨电针“百会”“神庭”对VD大鼠学习与记忆的作用及其机制，为电针治疗VD提供实验基础。

1 材料

1.1 动物与分组 SPF级健康雄性SD大鼠35只(3月龄)，体质量(200±20)g，由安徽省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(皖)2011-0002。动物饲养在室温20～25 ℃、相对湿度40%～75%的环境中。适应性饲养1周后，采用随机数字表法将其分为假手术组、模型组、电针非穴位组、电针穴位组和奥拉西坦组，每组7只。实验手术中未出现大鼠死亡情况。行为学实验结束后，动物经过量戊巴比妥钠注射安乐死，4只动物用于Western blot检测，3只动物用于透射电子显微镜观察实验。实验过程中对动物各项处理方法均按照《关于善待实验动物的指导性意见》及动物伦理相关规定执行。

1.2 主要试剂及仪器 奥拉西坦(批号 20030301)：中国湖南健朗药业有限责任公司；β-actin抗体(批号 3700、1∶1 000)、GluA1抗体(批号 13185、1∶1 000)、GluN2B抗体(批号 14544、1∶1 000)、p-GluN2B(批号 4209、1∶1 000)：美国Cell Signaling Technology公司；SDZ-Ⅱ型电子针疗仪：苏州华佗医疗器械有限公司；一次性不锈钢针灸针(0.25 mm×25 mm)：苏州华佗医疗器械有限公司；电泳仪：美国Bio-Rad公司；165-8000型电泳槽：美国Bio-Rad公司；UC-7切片机：德国LEICA；7700型透射电子显微镜：日本HITACHI。

2 方法

2.1 改良型双侧颈动脉结扎模型及干预 模型组、电针非穴位组、电针穴位组和奥拉西坦组大鼠采用改良型双侧颈动脉结扎模型[10]：2%戊巴比妥钠(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定于手术板上。颈部皮肤剃毛后用75%乙醇棉球进行常规无菌操作。沿颈部正中线切2 cm的切口，钝性分离皮下组织，于肌肉间隙找到左颈总动脉，分离迷走神经，用4-0手术线永久结扎后缝合皮下组织及皮肤。放回鼠笼休息并注意保温，待完全苏醒后转移到鼠房饲养。1周后进行右侧颈总动脉分离结扎，方法同前。假手术组大鼠也采用相同的手术操作，但不结扎双侧颈总动脉。

术后第2天，电针穴位组大鼠在2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后将其俯卧位固定在操作台上，根据《实验针灸学》[11]选取“百会”“神庭”，其中“百会”位于顶骨正中，“神庭”位于前正中线上，在额顶骨缝交界线前方处。穴位常规无菌操作后，选用一次性针灸针进行针刺治疗，“百会”穴向后斜刺2 mm，“神庭”穴向上斜刺2 mm，针刺后选用SDZ-Ⅱ型电子针疗仪，疏密波，强度0.5 mA，频率1 Hz/20 Hz。每次电针干预30 min，每日1次，共治疗14 d。电针非穴位组在取两个固定非穴点(穴位旁开0.2寸)，电针干预30 min。假手术组和模型组大鼠分别给予相同时间、相同水平的抓握刺激，不进行电针干预。奥拉西坦组大鼠予以奥拉西坦盐水溶液50 mg/kg腹腔注射，每日1次，共治疗14 d。

2.2 检测指标及方法

2.2.1 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫评估空间学习和记忆功能，水迷宫由一个直径为1.6 m的黑色圆形水池组成，水温控制在(25±2)℃。隐藏在水下的平台(直径为12 cm，高20 cm)位于第四象限的中心。使用连接到固定在水迷宫中心上方的视频跟踪系统获取数据。定位巡航实验为期4 d。每只大鼠从任意象限面向池壁被放入水中，让其在60 s内找到隐藏的平台。如果大鼠在60 s内未能找到平台，则由实验者引导至平台并记录逃离潜伏期为60 s。空间探索实验在定位巡航结束后的第5天，用于测试大鼠穿越平台的次数以及目标象限停留的时间。行为学试验结束后，动物经过量戊巴比妥钠麻醉安乐死，并取海马组织。

2.2.2 Western blot检测海马突触相关蛋白水平 大鼠海马组织加细胞裂解液，4 ℃冰上研磨，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清。1∶1加入蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴加热10 min，以充分变性蛋白，经SDS-PAGE电泳，转膜，漂洗5 min，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加入PSD-95(1∶1 000)、GluA1(AMPA receptor subunit GluR1)(1∶1 000)、GluN2B(NMDA Receptor 2B)(1∶1 000)和磷酸化GluN2B(1∶500)抗体，缓慢摇动4 ℃孵育过夜。加入洗涤液TBST(10 min×3)。加入二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h。加入洗涤液TBST，10 min×3次。采用化学发光试剂显影成像。使用Image J软件对图像进行分析，计算条带的光密度值。

2.2.3 透射电子显微镜观察海马CA1区突触数量 取新鲜海马CA1区组织(1 mm×1 mm×1 mm)，置2.5%戊二醛液中固定6 h，将标本用0.1 mmol/L磷酸缓冲液洗3次后，锇酸固定2 h，用上述缓冲液洗3次后，逐级梯度乙醇、丙酮脱水，环氧丙烷过渡；然后用环氧树脂包埋，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片机切片，厚度70 nm；醋酸铀，硝酸铅液染色，用透射电子显微镜观察拍照。

3 结果

3.1 电针对改良型双侧颈动脉结扎模型大鼠学习和记忆功能的影响 水迷宫实验分为学习和测试两个时期。各组大鼠在1～4 d学习期，逃避潜伏时间显著缩短，与假手术组比较，模型组大鼠第4天逃避潜伏时间显著延长(P<0.05)；与模型组比较，电针穴位组和奥拉西坦组第4天逃避潜伏时间显著缩短(P<0.05)。与假手术组比较，测试期模型组大鼠跨越平台次数减少，目标象限停留时间显著缩短(P<0.05)。与模型组比较，电针穴位组和奥拉西坦组大鼠跨越平台次数增加，目标象限停留时间显著延长(P<0.05)。电针非穴位组大鼠学习期逃避潜伏期与测试期跨越平台次数和目标象限停留时间与模型组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1。

3.2 电针对改良型双侧颈动脉结扎模型大鼠脑质量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑质量显著增加(P<0.05)；与模型组比较，电针穴位组和奥拉西坦组大鼠脑质量显著降低(P<0.05)，而电针非穴位组大鼠脑质量无显著变化(P>0.05)；与奥拉西坦组比较，电针穴位组大鼠脑质量显著降低(P<0.05)。见图2。

注:A.假手术组;B.模型组;C.电针非穴组;D.电针穴位组;E.奥拉西坦组;与假手术组比较,∗P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.3 电针对改良型双侧颈动脉结扎模型大鼠大脑海马CA1区突触数量的影响 假手术组大鼠海马CA1区突触数量丰富，而模型组大鼠和电针非穴位组大鼠海马CA1区突触数量明显下降；而电针穴位组大鼠海马CA1区突触密度增加。见图3。

注：A.假手术组；B.模型组；C.电针非穴组；D.电针穴位组

3.4 电针对改良型双侧颈动脉结扎模型大鼠大脑海马突触蛋白PSD95、GluA1和GluN2B表达水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠海马PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。与模型组比较，电针穴位组PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表达水平显著上升(P<0.05)，电针非穴位组PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

4 讨论

VD属于中医“呆证”范畴，其病位在脑，病机为髓海不足、清窍闭阻、神机失用。“百会”属督脉，位于巅顶，是督脉、手少阳三焦经、足太阳膀胱经、足少阳胆经和足厥阴肝经的交会穴，能通达阴阳脉络，连贯周身经穴，可振复阳气、疏通经络、调一身之阴阳之气，故“百会”为治疗精神情志类疾病的要穴。“神庭”也属于督脉，为神志所在，其功在神，为督脉、阳明经、足太阳交汇之穴。《针灸甲乙经》：“神者，天部之气也；庭者，庭院也。”现代临床研究也表明，“百会”“神庭”穴是调节大脑功能的要穴，具有较为明显的安神定志、调节情志、醒脑开窍的功效，可有效改善认知功能，是极具研究价值的穴组[8-9]。本研究选择“百会”“神庭”二穴，并施以电针，评价电针对VD大鼠学习和记忆功能的影响。

注：A.假手术组；B.模型组；C.电针非穴组；D.电针穴位组；与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

改良型双侧颈动脉结扎模型是一种经典的制作VD模型的方法，该模型广泛应用于VD发病机制的研究和筛选相关的治疗方法[12]。故本研究选择改良型双侧颈动脉结扎大鼠模型评价电针“百会”“神庭”对VD大鼠学习和记忆的作用及探究其机制。本研究发现，改良型双侧颈动脉结扎能延长大鼠训练期平台逃避潜伏期，并缩短大鼠测试期平台象限穿越次数和平台象限停留时间。该结果提示，改良型双侧颈动脉结扎能造成大鼠空间学习和记忆功能的下降。本研究选择奥拉西坦作为阳性对照药[13]，结果表明，奥拉西坦能改善模型复制造成的学习和记忆能力的损伤，进一步证明该研究模型的成功。模型组大鼠经电针“百会”“神庭”治疗后，空间学习和记忆功能都得到显著改善，而电针非穴组大鼠学习和记忆功能未能得到改善。值得注意的是，本研究选择改良型双侧颈动脉结扎大鼠模型，双侧颈动脉的结扎间隔1周的时间，成功地避免了传统双侧颈动脉结扎复制模型引起动物的高死亡率[10]。因此，该模型是一种较好的VD模型。

本研究结果发现，双侧颈动脉结扎后，大鼠脑组织出现水肿等现象，且大脑的质量显著增加，这和以往研究结果[14]相一致。电针“百会”“神庭”能阻止双侧颈动脉结扎造成的大鼠脑质量的增加，而电针非穴组则不具备这种功效。此外，与奥拉西坦组比较，电针“百会”“神庭”也展示了更优的效果，该结果也提示电针和奥拉西坦发挥改善VD学习和记忆功能的机制不完全相同。据文献报道，奥拉西坦主要促进磷酰胆碱和磷酰乙醇胺合成，提高大脑中ATP与ADP的比值，使大脑中蛋白质和核酸的合成增加，从而改善AD和记忆障碍患者的记忆和学习功能[15]。而电针可通过多种机制改善学习和记忆功能，如抗炎、抗氧化和阻止细胞凋亡等[16]。

海马是大脑内重要的脑区，与学习记忆功能密切相关[17-18]，双侧颈动脉结扎能导致海马结构的萎缩及功能的减弱。神经细胞间的信息传递主要通过突触来完成，而突触的损伤意味着神经细胞间信息传递的异常。突触损伤发生在VD发病的晚期，且与认知功能障碍密切相关[5]。对VD发病中突触可塑性的研究有利于进一步阐明其发病机制。本研究重点观察海马CA1突触的结构以及突触相关蛋白的表达水平，来探究电针“百会”“神庭”对海马突触结构的影响。透射电子显微镜结果显示，模型组大鼠海马CA1区突触结构的数量显著减少，电针“百会”“神庭”能逆转改良型双侧颈动脉结扎模型造成的突触损伤，而电针非穴不具备逆转双侧颈动脉结扎造成的突触损伤的功效。该结果表明，电针“百会”“神庭”对双侧颈动脉结扎造成的突触结构损伤确有改善效应，同时也说明穴位的特异性作用。

为进一步研究电针“百会”“神庭”对改良型双侧颈动脉结扎模型大鼠海马突触损伤修复的机制，本研究选择性检测了突触后膜蛋白PSD-95及突触受体蛋白的表达水平。突触后致密物是位于中枢神经系统突触后膜的特殊结构，是突触后信号转导和整合的关键物质。根据分子质量不同，可将其分为PSD-95和PSD-93。海马CA1区突触后膜广泛分布PSD-95。因此，通过检测PSD-95的表达水平可进一步确证突触结构的变化。Western blot检测结果表明，模型组大鼠海马PSD-95表达水平显著下降，电针“百会”“神庭”能显著提升PSD-95表达水平，而电针非穴位未能提升该蛋白的表达水平，该结果进一步验证电针“百会”“神庭”对改良型双侧颈动脉结扎模型造成的突触损伤具有改善作用。

突触后膜主要的膜受体包括AMPAR和NMDAR，而GluA1是AMPAR的主要亚型，负责海马突触的基础传递[19]。NMDAR由NR1、N2A和N2B亚基构成，参与突触可塑性的调控。本研究中，笔者检测了GluA1的表达水平，结果显示模型组大鼠海马GluA1的表达水平显著下降，而电针能改善改良型双侧颈动脉结扎造成的GluA1下降。此外，笔者检测了各组大鼠海马GluN2B和磷酸化GluN2B的表达水平变化。磷酸化GluN2B是一种活化的GluN2B，参与NMDAR对Ca2+的调控[20]。因此，磷酸化GluN2B是NMDAR活性的亚基。模型组大鼠海马GluN2B和磷酸化GluN2B的表达水平均下降，而电针“百会”“神庭”促进GluN2B的表达及GluN2B的磷酸化。该结果也提示改良型双侧颈动脉结扎模型动物海马突触可塑性的损伤及电针“百会”“神庭”对其的逆转作用。

总之，电针“百会”“神庭”可能通过调节突触结构改善VD大鼠学习记忆功能，其分子机制可能与增加突触蛋白PSD95、GluA1和GluN2B的表达水平有关。海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)是学习记忆重要的模型，而LTP的诱导和维持与AMPAR和NMDAR的功能密切相关[21]，本研究未能用电生理的方法来评价改良型双侧颈动脉结扎模型和电针对LTP诱导的影响，后期课题组将进一步展开该方面的研究。此外，Arc等蛋白参与LTP的维持，后期研究应该更多聚焦NMDAR的下游信号通路的变化，进一步阐明电针“百会”“神庭”的作用机制。