胡国君，张尊平，范旭东，任 芳，翟秀丽，时晓燕，董雅凤

（1 中国农业科学院果树研究所，国家落叶果树脱毒中心，辽宁兴城125100）（2 赤峰市森林草原保护发展中心）

我国苹果的栽植面积和产量稳居世界前列，然而，研究表明，我国苹果普遍感染病毒[1]，而且随着接穗和苗木流通的日益频繁，苹果病毒病的发生呈上升趋势。苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）和苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）是常见的苹果病毒[2]，且均为潜隐性病毒，一般在寄主上不表现症状，只有在感病寄主或是指示植物上才产生症状[3-4]。3 种病毒通常混合感染，可引起树体生长量减少，产量降低，果实品质下降，严重时病树生长急剧衰退，以致枯死，给农业生产带来巨大的损失[5]。

上述3 种苹果病毒主要通过嫁接传染，随接穗、苗木等远距离扩散，目前还未发现传毒介体。果树病毒病不能通过药剂进行防治，培育和栽培无病毒苗木是防控苹果病毒的根本途径[6]。目前，茎尖培养、热处理、化学处理和超低温处理等均可用于苹果病毒的脱除，而且具有良好的脱除效果[7-8]。自然条件下，不同苹果样品中所携带的病毒种类和数量是不同的，其与脱毒效果的关系目前还不是很清楚。为了明确病毒数量对脱毒效果的影响，本研究以感染不同数量和种类病毒的苹果试管苗为研究材料，比较热处理和热处理结合化学处理2 种脱毒方法对苹果病毒的脱除效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验室保存的富嘎、维纳斯黄金和新2001 富士3 个苹果品种的试管苗。

1.2 试剂及仪器耗材

rTapDNA 聚合酶、10 mmol/L dNTPs，购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）；反转录酶M-MLV 购自普洛麦格公司（Promega）；DNA Mark II 购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 热处理脱毒

对保存的试管苗进行扩繁，培养30～35 d 后继代，每次继代切取1 cm 左右的茎尖转到新鲜的MS基本培养基中，期间对样品的带毒情况进行复检，确保带毒。

试管苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的健壮植株，切取0.7 cm 茎尖移入新鲜的MS 培养基中，每瓶2～3 株，24 ℃条件下进行培养，培养室内光培养∶暗培养＝16 h ∶8 h，光照强度为40 μmol·s-1·m-2。1 周左右移入光照培养箱中，箱内温度为24 ℃，每天升温2～3 ℃，最终升温至36 ℃，处理20 d。富嘎12 株为1 次重复，维纳斯黄金6 株为1 次重复，新2001 富士10 株为1 次重复，均3 次重复，以未进行热处理的为对照。

期间，观察记录植株的株高和增殖情况，处理20 d 时切取1.0 mm 的茎尖（包括主芽和新生的侧芽）移入新鲜的MS 培养基中，50～60 d 后进行第1 次继代，记录再生植株的成活率，当植株继代2次后进行病毒检测。

1.4 热处理结合化学处理脱毒

含抗病毒剂培养基的配制：先将抗病毒剂病毒醚配制成一定浓度的母液，过滤除菌后加入高温灭菌的MS 培养基中，使病毒醚的终浓度为25 μg/mL，混匀后置于室温备用。

脱毒处理：切取0.7 cm 茎尖移入含病毒醚的培养基中，每瓶2～3 株。其余处理方式同1.3。

1.5 病毒检测

总RNA 的提取：参照范旭东等[9]的方法。

反转录：取总RNA 3 μL、随机引物1 μL、DEPC处理去离子水6 μL 放入1 个离心管中，72 ℃10 min，冰上3 min。加入5×RT buffer 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L each）1 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL混合液，用水补足至20 μL。混匀后42 ℃10 min，37 ℃1 h，72 ℃5 min，冰浴3 min，-20 ℃备用。

PCR：参照胡国君等[10]的方法。检测引物参照表1。

表1 3 种苹果病毒检测用引物

1.6 数据分析

各品种2种脱毒处理的再生植株平均成活率（%）＝［（热处理的成活茎尖＋热处理结合化学处理的成活茎尖）/（热处理后切取的茎尖＋热处理结合化学处理后切取的茎尖）］×100

热处理脱毒的再生植株成活率（%）＝（成活的茎尖/切取的茎尖）×100

热处理结合化学处理的再生植株成活率（%）＝（成活的茎尖/切取的茎尖）×100

3 个品种中ACLSV（或ASGV、ASPV）的平均脱除率（%）＝［3 个品种的2 个脱毒处理组中所有不含ACLSV（或ASGV、ASPV）的再生植株总和/3 个品种的2 个脱毒处理组中所有检测的再生植株总和］×100

各品种中某种病毒的平均脱除率（%）＝（2 个脱毒处理组中所有不含该病毒的再生植株总和/2 个脱毒处理组中所有检测的再生植株总和）×100

各品种的某个脱毒处理中某种病毒的平均脱除率（%）＝（该脱毒处理组中所有不含该病毒的再生植株总和/该脱毒处理组中所有检测的再生植株总和）×100

2 结果与分析

2.1 3 个苹果品种试管苗的带毒情况

采用RT-PCR 技术对3 个苹果品种的试管苗进行病毒检测。从表2 可以看出，富嘎携带ACLSV、ASGV、ASPV 3 种病毒，维纳斯黄金携带ASGV、ASPV 2 种病毒，新2001 富士仅携带ASGV 1 种病毒。继代培养后，每个品种随机抽取10 株试管苗进行病毒检测发现，3 个品种携带的病毒种类不变。

表2 3 个苹果品种试管苗对3 种苹果病毒的携带情况

2.2 脱毒处理对3 个苹果品种试管苗的影响

2.2.1 生长状况

与对照相比，处理10 d 时，富嘎脱毒处理的试管苗受高温影响均表现整体变黄的现象；处理结束时（20 d），植株整体较黄，长势较弱，部分叶片变褐色。维纳斯黄金的试管苗耐热性相对较好，处理10 d 时与对照的差别不大；处理结束时（20 d），整体较黄，部分叶片变褐色。新2001 富士热处理脱毒的植株长势弱，处理结束时，底部叶片出现黑褐色；而热处理结合化学处理脱毒的植株长势较好，处理结束时，只有部分叶片变褐色。处理结束后，3个品种的脱毒试管苗均未有死亡的（图版1、表3）。

表3 3 个苹果品种试管苗脱毒处理过程中植株的生长状况

2.2.2 株高和增殖

从图1 可以看出，处理结束后，植株株高和增殖品种间差异较大。富嘎热处理脱毒植株的株高和增殖与对照无显著差异，但热处理结合化学处理脱毒植株的株高显著高于对照，而增殖数显著低于对照组植株。维纳斯黄金2 组脱毒处理植株的株高和增殖与对照没有显著差异。新2001 富士2 组脱毒处理植株的株高和增殖数均显著低于对照组植株。

图1 3 个苹果品种试管苗脱毒处理20 d 时的株高和增殖情况

2.3 脱毒处理对3 个苹果品种试管苗再生植株成活率和病毒脱除率的影响

从表4 可以看出，第1 次继代结束后，维纳斯黄金2 种脱毒处理再生植株的平均成活率最高，为83.2%；富嘎和新2001 富士2 种脱毒处理再生植株的平均成活率差别不大，分别为64.0%和59.2%。富嘎和维纳斯黄金热处理脱毒的再生植株成活率均略高于热处理结合化学处理脱毒的，分别高5.4、2.8 个百分点，而新2001 富士热处理脱毒的再生植株的成活率低于热处理结合化学处理脱毒的，低18.4 个百分点。

表4 3 个苹果品种脱毒试管苗再生植株的成活率和病毒脱除率

继代2 次后，3 个苹果品种试管苗热处理脱毒的再生植株脱毒率均较低，富嘎和新2001 富士均未获得无毒植株，而维纳斯黄金不足20%。3 个苹果品种试管苗热处理结合化学处理脱毒的再生植株均获得了无毒种苗，富嘎和维纳斯黄金的脱毒率较高，分别为94.7%和88.9%；新2001 富士较低，为46.2%（表4）。

2.4 不同病毒的脱除效率

分析发现，3 个苹果品种中，ACLSV、ASGV和ASPV 的平均脱除率分别为56.1%、41.0%和63.9%。富嘎和维纳斯黄金中ASPV 的平均脱除率分别为65.9%和60.0%，富嘎、维纳斯黄金、新2001富士中ASGV 的平均脱除率分别为43.9%、50.0%、27.3%。

3 讨论与结论

本研究采用热处理、热处理结合化学处理对3个携带不同种类病毒的苹果品种试管苗进行脱毒，结果显示，脱除效率与病毒种类数量不存在明显的相关性，但与病毒种类关系密切，3 种病毒中ASGV最难于脱除，直接影响品种的脱毒率。如富嘎热处理脱毒的再生植株中ACLSV、ASGV 和ASPV 的脱除率分别为18.2%、0、36.4%，所有再生植株中均携带ASGV，因此该品种热处理脱毒后未获得无毒植株。其次，脱除效率与苹果品种有关，即不同品种间同一病毒的脱除率存在差异，富嘎和维纳斯黄金热处理脱毒的再生植株中ASPV 的脱除率分别为36.4%、27.3%。

苹果主要通过嫁接进行繁育，砧木或接穗一方带毒，植株将终身携带。病毒主要依赖寄主完成繁衍，因此，一般的化学农药很难对其造成威胁。目前，脱毒处理是获得无病毒苗木最有效的方法。其中，热处理是传统的植物病毒脱除方法，其优点是所需设备简单，操作容易，目前通过高温处理已经获得多种果树的无病毒植株[14-18]。然而，该方法存在一定的局限，即高温条件下植物的死亡率较高，尤其是对一些不耐高温的植物。化学处理在植物病毒的脱除研究中也被广泛应用，所用的抗病毒剂大多为一些核酸类似物。病毒醚为常用的病毒抑制剂，在果树病毒的脱除中被广泛引用[7,19-22]。但在使用过程中发现，当病毒醚的浓度≥50 μg/mL 时，植株产生药害，叶片上出现褪绿和坏死斑，严重时甚至导致植株死亡[22]。

除上述2 种方法外，现有的脱毒方法均存在一定的局限，单独选择某一种方法进行脱毒处理很难获得满意的脱除效果，因此，通常选择2 种或者2种以上的方法同时脱毒，本研究选用的热处理结合化学处理的脱除效果明显优于单独热处理的脱除效果。此外，热处理结合超低温处理、化学处理结合低温处理、热处理结合低温处理等方法也在苹果病毒的脱除中得到应用[23-26]。

综上，果树脱毒的脱除效率与待脱毒的品种类型及病毒的种类有关，在脱毒处理前要综合考虑不同脱毒方法的利弊，选择适宜的方法，为了获得较好的脱除效果，可同时选择2 种或2 种以上的脱除方法。