丁恩慈 郭建华 沈婕

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种逐渐进展的动脉炎性疾病。随着世界人口老龄化及风险因素暴露时间延长，AS 易损斑块的破裂和继发血栓导致卒中的风险增加[1]。分子成像可以在疾病临床症状出现之前便提供相关的病理生理学信息，使得准确测定斑块的组成成分并识别易损和高风险斑块成为可能[2]。PET/CT 可同时了解斑块的狭窄程度及斑块的代谢情况，能够无创性评价斑块性质，利用其显像剂在人体内AS 斑块区特异性或非特异性聚集，使得冠状动脉许多早期隐匿性病变（如炎性病变、早期微钙化灶等）得到显示[3-4]。

目前，氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）、氟化钠（18FNaF）、68Ga-奥曲肽（68Ga-DOTATATE，简写为68Ga-DOTA）等已经用于AS 斑块的研究。18F-FDG 广泛用于活体炎症细胞的识别，18F-NaF 在体内AS 斑块的钙化中特异性聚集[5]，68Ga-DOTA PET/CT 对非钙化斑块和点状斑块等高风险冠状动脉病变有良好的诊断准确性[6]。但国内外尚无将这3 种显像剂同时用于动物的研究。本研究拟采用3 种显像剂的PET/CT 对不同月龄ApoE 基因敲除小鼠的AS 易损斑块显像，探讨3 种显像剂检测易损斑块的可行性及临床应用价值，并筛选出对易损斑块最有价值的显像剂。

1 材料与方法

1.1 实验动物 高脂组为雄性ApoE 基因敲除小鼠18 只，8 周龄，体质量（19±2）g，全程喂养高脂饲料（胆固醇1%、蛋黄粉10%、猪油10%、猪胆盐0.35%、基础饲料78.65%）。喂养17 周、23 周时各死亡1 只，及时补充同类型同月龄小鼠。对照组为雄性C57BL/6 普通小鼠18 只，8 周龄，体质量（20±2）g，全程喂养普通饲料。所有小鼠及饲料均购自天津放射医学研究所动物中心[实验动物使用许可证：SYXK（津）2019-0002]。记录饲养前后全部小鼠的体质量、血脂（游离脂肪酸、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇）水平。动物实验经天津市第一中心医院伦理委员会批准。

1.2 小鼠分组 高脂组和对照组均采用随机数字表法分别均分为2 组，即高脂1 组、高脂2 组、对照1 组、对照2 组，每组9 只。高脂1 组及对照1 组于喂养18 周时行PET/CT 检查，高脂2 组及对照2 组于27 周时行PET/CT 检查。4 组小鼠各自随机分成3 个小组，每组3 只，分别给予3 种显像剂（18F-FDG、18F-NaF、68Ga-DOTA）进行检查。

1.3 PET/CT 成像 采用美国GE 公司的Explorer Vista micro-PET/CT 设备及图像后处理系统。显像剂（18F-FDG、18F-NaF、68Ga-DOTA）由解放军总医院（301 医院）PET-CT 中心提供，放化纯度≥95%。所有小鼠禁食6 h 后经尾静脉注射18F-FDG（或18F-NaF、68Ga-DOTA）(剂量均为1.0 mCi/kg)，60 min 后吸入异氟烷麻醉，将小鼠仰卧位固定于塑料板上以尽可能减少移动，随后进行PET/CT 扫描。CT 扫描参数：管电压50 kV，管电流200 μA，曝光时间200 ms，扫描范围自小鼠头部至尾部；PET 进行三维采集，采集时间共15 min，PET 影像采用CT 衰减校正和滤过反投影算法进行影像重建。显像结束后处死小鼠，从升主动脉向下剖离至腹主动脉髂血管分叉处，进行离体腹主动脉PET/CT 成像。

1.4 影像分析 由2 位核医学科5 年以上经验的主治医师分别对各组小鼠的PET/CT 影像进行测量和分析，最后取2 位医师测量值的平均值，意见不一致时商讨确定。观察及测量内容：①记录腹主动脉长度，在PET 及CT 上综合确定AS 斑块区，记录斑块数量并测量每只小鼠腹主动脉的最大斑块长度。在CT 上测量斑块的平均CT 值，注意避开周围脂肪组织。②在PET 上测量斑块的标准化摄取值（standard uptake value，SUV）并记录最大值（SUVmax）及平均值（SUVmean）。分别计算不同显像剂的最大和平均斑块靶本比值（target-to-background ratio，TBR），即TBR-SUVmax及TBR-SUVmean；计算公式为TBR=SUV斑块/SUV本底，其中SUV 本底为腹主动脉无摄取区域的SUV 值，SUV斑块以SUVmax高于本底20%的病灶作为阳性斑块，测量其SUV 值。

1.5 病理分析 根据Naghavi 等[7]归纳的病理学标准，有以下病理学特征之一即可视为AS 易损斑块：①斑块脂质核心增大伴纤维帽变薄、巨噬细胞浸润、有破裂倾向；②亚阻塞血栓形成伴早期机化的破裂斑块；③含蛋白糖基质平滑肌细胞丰富的侵蚀倾向斑块；④亚阻塞血栓形成的侵蚀斑块；⑤斑块内出血；⑥浸润血管壁的钙化结节；⑦慢性狭窄性斑块伴严重钙化、陈旧性血栓形成及管腔向心性狭窄。对4 组小鼠的离体腹主动脉进行病理分析，记录每只小鼠腹主动脉易损斑块数量。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0 软件进行数据分析。采用Kolmogorov-Smirnov 检验评估计量资料分布的正态性，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2 组间比较采用独立样本t 检验；3组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠离体血管的病理结果 高脂1 组、高脂2 组的腹主动脉分别有易损斑块35、38 处，对照1 组、对照2 组分别有易损斑块6、8 个。高脂组病理主要表现为动脉内壁表面多量胶原纤维构成的纤维帽，其内多发泡沫细胞和胆固醇结晶，局部炎症细胞浸润；免疫组化显示泡沫细胞阳性（图1）。对照组则血管较平滑，斑块偶发。

图1 高脂组小鼠腹主动脉病理及免疫组化图。A 图为HE 染色（×200）。B 图为天狼猩红染色（×200），示腹主动脉不同纤维被染成不同颜色。C 图为免疫组化图。

2.2 高脂组与对照组小鼠离体血管基本情况比较 高脂1 组及对照1 组在PET/CT 上分别发现32、5 处斑块，高脂2 组及对照2 组分别发现34、6处斑块。高脂组及对照组间血管长度差异均无统计学意义（P＞0.05）；高脂组的最大斑块长度均高于对照组（P＜0.05）。高脂2 组血管斑块的平均CT 值高于对照2 组（P＜0.05），高脂1 组与对照1 组的斑块平均CT 值差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 高脂组（1 组、2 组）和对照组（1 组、2 组）小鼠离体血管的基本情况比较

2.3 不同显像剂在不同月龄高脂组间的显像结果比较18F-FDG 和18F-NaF 显像后，斑块区血管壁的CT 密度不均匀，PET 和PET/CT 影像上均可见多发异常放射性浓集（图2、3）。68Ga-DOTA 显像后，斑块区血管壁CT 密度不均匀，但PET 和PET/CT 影像上未见异常放射性浓集。

2.3.118F-FDG PET/CT 高脂1 组及2 组分别发现12、13 处斑块。高脂2 组的本底SUVmax及SUVmean均高于高脂1 组（P＜0.05），而高脂1 组的TBR-SUVmax和TBR-SUVmean均高于高脂2 组（P＜0.05）。2 组间18F-FDG 的SUVmax、SUVmean差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。PET/CT 显像如图2 所示。

表2 2 个高脂组间斑块18F-FDG PET/CT 代谢参数比较

图2 高脂组小鼠离体腹主动脉斑块18F-FDG PET/CT 影像。由上到下每行分别为CT、PET 和PET/CT 融合图影像，从左到右分别为血管的横断面、矢状面、冠状面影像。

2.3.218F-NaF PET/CT 高脂1 组及2 组分别发现11、12 处斑块。2 组间代谢参数差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表3。

表3 2 个高脂组间斑块18F-NaF PET/CT 代谢参数比较

2.3.368Ga-DOTA PET/CT 高脂1 组及2 组的68Ga-DOTA PET/CT 上分别发现9 处斑块。高脂1 组的本底SUVmax及SUVmean均高于高脂2 组（P＜0.05），其他代谢参数的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。详见表4。

表4 2 个高脂组间斑块18Ga-DOTA PET/CT 代谢参数比较

2.4 高脂组小鼠3 种显像剂间PET/CT 代谢参数比较 高脂1 组和高脂2 组中，18F-FDG 、18F-NaF 和68Ga-DOTA PET/CT 的SUVmax（F1组=214.424，F2组=165.846）、SUVmean（F1组=107.590，F2组=80.581）、本底SUVmax（F1组=48.356，F2组=53.926）及本底SUVmean（F1组=48.356，F2组=34.442）的差异均有统计学意义（均P＜0.001），其中18F-NaF 的上述参数均高于18FFDG 显像，18F-FDG 及18F-NaF 均高于68Ga-DOTA（均P＜0.05）；而3 种显像剂间TBR-SUVmax（F1组=50.798，P=0.239；F2组=52.921，P=0.478）、TBR-SUVmean（F1组=55.418，P=0.130；F2组=57.897，P=0.275）的差异无统计学意义。

3 讨论

易损斑块的早期识别是疾病预防的基础，已成为心血管病诊断及预防的重要手段[8]。近年来核素分子显像已经用于易损斑块识别及疗效的监测，多模态分子影像平台（如PET/CT、PET/MR、MR/CT）诊断动脉易损斑块不仅可以显示斑块的位置、大小及形态，还可以检测斑块的组成成分，评估斑块的稳定性和易损程度[9-10]。本研究将18F-FDG、18F-NaF 及68Ga-DOTA 这3 种显像剂用于不同月龄的AS 模型小鼠和对照组，分析其检测AS 易损斑块的可行性及临床应用价值。

图3 高脂组小鼠离体腹主动脉斑块18F-NaF PET/CT 影像。由上到下每行分别为CT、PET 和PET/CT 融合图影像，从左到右分别为血管的横断面、矢状面、冠状面影像。

3.1 PET/CT 在AS 小鼠模型易损斑块中的应用 本研究主要对高脂组及对照组小鼠离体腹主动脉进行了3 种显像剂的PET/CT 显像，同月龄小鼠高脂组的病变数量、长度均较对照组明显增加，CT 值也更高，而高月龄组（高脂2 组）小鼠离体血管的斑块病灶数量及最大病变长度均较低月龄组（高脂1 组）增加，说明ApoE 基因敲除小鼠配合高脂饲养可以成功获得AS 小鼠模型。这类动物模型与人类血管的内膜钙化情况相似，动脉硬化早期会产生微钙化，易损斑块中可检测到微钙化和大钙化[11]，18F-NaF 在活动性微钙化中聚集的特点使18F-NaF PET/CT 显像成为可能。王等[12]研究发现ApoE-/-小鼠主动脉对18F-FDG 的摄取值明显高于对照组C57BL/6N 小鼠，并在血管离体显像中发现显像斑块内巨噬细胞数量明显高于未显像的斑块，说明18F-FDG 的摄取能反映斑块的炎症程度，进一步识别易损斑块。生长抑素受体结合物68Ga-DOTA，可以特异性结合在人类巨噬细胞处特异性表达的生长抑素受体2。国外有研究[13]报道ApoE 基因敲除小鼠模型中发现68Ga-DOTA 在巨噬细胞聚集处摄取明显增高。

3.218F-FDG 用于AS 斑块的价值18F-FDG 是目前比较实用的用于动脉硬化斑块PET 显像研究的显像剂，已经成功用于主动脉和颈动脉的斑块显像。18F-FDG 在炎症区积聚的特点已经被用来量化AS 中积累的炎症细胞[14]。其中，易损斑块中的巨噬细胞是促使冠心病向不良心血管事件不断进展的因素，其数量与SUV 值高度相关[15]；SUVmax可间接反映AS 易损斑块的炎症程度和稳定性。赵等[16]采用18F-FDG PET/CTA 成像检测兔主动脉易损斑块，发现在斑块破裂诱发实验之前，易损斑块FDG 摄取值明显高于稳定斑块；诱发实验后，有血栓形成的动脉段的FDG 摄取值明显高于无血栓形成的动脉段。本研究对小鼠进行18F-FDG 显像发现，高脂组腹主动脉斑块区存在放射性异常浓集，相应部位血管壁的CT 密度不均匀，故证实18F-FDG PET/CT 对于斑块识别具有较高的特异性。但18F-FDG 用于冠状动脉活体易损斑块的特异性并不强，主要因为心肌细胞对其的大量摄取在一定程度上会抑制较细血管对其摄取。通过禁食、降低血糖等方法可以有效降低心肌细胞对18F-FDG 的摄取，未来有望用于临床。

3.318F-NaF 用于鉴别AS 斑块有重要的价值 AS斑块的钙化是一种与新骨形成极为相似的受调控的主动性代谢过程，其钙盐的主要成分是羟磷灰钙，18F-NaF 通过替换羟基参于羟磷灰钙的代谢，在血管早期钙化及微钙化中浓集[17]。使用18F-NaF micro-PET/CT 即可在临床前研究中检测微钙化，具有较高的敏感性和特异性[18]。陈等[19]通过兔AS 模型活体显像研究提出，18F-NaF 较18F-FDG 能够更准确地用于检测微钙化及易损斑块。本研究发现18FNaF 显像的SUVmax值要高于18F-FDG，更容易识别斑块，但18F-NaF 显像对小鼠18 周及27 周时的代谢参数的差异无明显统计学意义，说明其在早期及中晚期斑块的辨认上可能有同等价值。McKenney Drake等[3]发现，相比18F-FDG，18F-NaF 放射性活性与疾病的临床和病理有更高的相关性。18F-NaF 摄取标志着中早期不稳定斑块中微钙化灶的存在，其摄取率与心血管疾病的发生风险呈正相关[20]。因此，18F-NaF 用于AS 病人可以提前鉴别易损斑块，有利于有效且针对性地治疗。

3.468Ga 标记的示踪剂用于AS 斑块的价值68Ga标记的示踪剂可用于AS 斑块成像，如68Gapentixafor 已用于冠状动脉等小血管成像[21-22]。68Ga-DOTA 在近年来也受到广泛关注，其对生长抑素受体2 有高度的亲和性和选择性，在巨噬细胞聚集处摄取明显增高，且具有TBR 较高、不易被心肌细胞摄取等特点，有可能成为未来评估不稳定斑块炎症活性良好的示踪剂，较18F-FDG 更适用于冠状动脉成像[6]。但本研究中发现68Ga-DOTA 对AS 斑块的检出极低，在不同月龄高脂小鼠中几乎无放射性浓集，可能是因为本研究中高脂组小鼠已经是AS 中期及后期，巨噬细胞聚集不够多，也可能是因为易损斑块本身不摄取68Ga-DOTA，因此不建议68Ga-DOTA 用于AS，至于其他68Ga 标记的显像剂有待进一步研究。

3.5 高脂小鼠中3 种显像剂的PET/CT 影像分析 高脂组小鼠18F-FDG 和18F-NaF 显像中斑块表现出放射性异常浓集，68Ga-DOTA 组则无明显放射性浓集，体现了前2 种显像剂检测AS 斑块的可行性及临床价值。同月龄小鼠离体血管18F-NaF 的斑块SUVmax与SUVmean、本底SUVmax与SUVmean均高于18FFDG 组，说明18F-NaF 较18F-FDG 识别易损斑块更加敏感；此外，18F-NaF 的心肌摄取较低，因而较18FFDG 更适用于冠状动脉显像。另外，本研究还比较了TBR 值，TBR 综合考虑了斑块及本底的摄取，可以去除本底的影响因素，是比较推荐使用的代谢参数。本研究中18F-NaF 和18F-FDG 的TBR 差异无统计学意义，可能与样本量较小有关，未来加大样本量研究也许能获得更可靠的结果。

3.6 局限性及展望 本研究局限性主要是小鼠实验样本量偏少，实验组活体显像阳性的小鼠数目偏少，对照组小鼠显像阳性部位更少，因此没有进行活体显像分析；由于样本量小，故未对3 种显像剂在离体血管中的诊断效能进行分析，未来将加大样本量进一步进行诊断效能的研究，并进一步将18FNaF 及18F-FDG 用于活体易损斑块的研究，为AS易损斑块的早期甄别提供更加可靠的无创性检查手段。