王苗利，薛瑞雪，张 月，蔺晓月，李玉杰，邢林林，孔祥华，王贵升

（山东省动物疫病预防与控制中心，山东 济南 250100）

流感病毒（Influenza virus）属于正粘病毒科流感病毒属，病毒结构由内而外分为核芯、基质蛋白和囊膜三个部分，基因组包含8个分节段的单股负链RNA（ss-RNA）。流感病毒的基因组RNA（vRNA）与核蛋白（NP）结合，并与RNA聚合酶复合体缠绕成致密的核糖核蛋白复合体（RNPs），以异源三聚复合体的形式存在于感染宿主的细胞核内，主要参与病毒RNA的合成。流感病毒感染的宿主范围十分广泛，包括人和其他哺乳动物、禽类、鸟类等。

不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是细胞核内的一类RNA结合蛋白，包括约30个高丰度表达的成员，这类蛋白可与新合成的不均一性RNAs（hnRNAs/pre-mRNAs）的内含子区域结合来协助完成内含子的剪切，并在mRNA从细胞核转运至细胞质的过程中结合mRNA来稳定mRNA结构。

本研究前期发现hnRNP H2蛋白能够抑制流感病毒复制，为进一步探究hnRNP H2是否会抑制流感病毒复制及相关机制，本研究采用双荧光素酶活性试验、免疫共沉淀试验等方法进行相关研究分析。

1 材料与方法

表1 引物序列

1.1 病毒株、细胞及质粒毒株A/WSN/1933(H1N1)、293T细胞系、犬肾上皮细胞系MDCK由本试验室保存；含有流感病毒聚合酶识别序列的萤火虫荧光素酶报告基因质粒（LUC）和含有CMV启动子序列的海肾萤光素酶报告基因质粒（RENILLA）由本实验室构建；pCMV-N-Flag载体、pCAGGS载体购自Novagen公司。

1.2 主要试剂兔抗beta Actin、Flag、hnRNP H2多抗和鼠抗A型流感病毒NP、M1、M2、PB1、PB2、PA多抗均购自ThermoFisher公司；T7 RNA体外转录试剂盒均购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和质粒提试剂盒购自QIAGEN公司；RIPA裂解液（弱）和SDS-PAGE凝胶配置试剂盒均购自碧云天生物技术公司；ECL发光液和Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit双荧光素酶报告基因检测试剂盒均购自翊圣生物公司。

1.3 引物设计根据GenBank中登录的hnRNP H2序列及流感病毒参考株的NP、PB1、PB2和PA序列，分别设计扩增引物。

1.4 利用双荧光素酶报告基因试验检测hnRNP H2蛋白对流感病毒聚合酶的影响将LUC、RENILLA、pCAGGS-NP、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-PA、pCMV-N-Flag-hnRNP H2（对 照 组pCMV-N-Flag）质粒共转染293T细胞，转染后30h，用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒按照说明书裂解细胞，取部分裂解上清加入蛋白上样缓冲液，95℃10 min变性处理后，用鼠抗NP、PB1、PB2、PA(1：1000)多抗和兔抗beta Actin、Flag(1：1000)多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG(1：10000)、HRP标记的羊抗鼠IgG(1：10000)为二抗，利 用western blot检 测NP、PB1、PB2、PA、hnRNP H2和beta Actin蛋白的表达水平。另取部分裂解上清于96孔板中，利用发光检测仪检测转染pCMV-N-Flag-hnRNP H2以及pCMV-N-Flag空载体样品的聚合酶活性。

1.5 利用免疫共沉淀试验检测hnRNP H2与流感病毒RNA相互作用分别将pCMV-N-Flag-hnRNP H2质粒和pCMV-N-Flag质粒转染293T细胞，24h后接种MOI 0.1 A/WSN/1933，感染后30 h，弃去上清，用RIPA裂解液（弱）4℃条件下裂解10～20 min，收集细胞裂解液，离心获得上清，上清液中加入Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarosse磁珠，4℃摇床过夜。预冷的RIPA洗涤4次，离心弃上清。将磁珠分为两部分：一部分用兔抗hnRNP H2(1：1000)多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG(1：10000)为二抗，利用western blot检测hnRNP H2蛋白的表达水平；另一部分提取RNA，RNA提取后分为两部分，一部分用Oligo(dT)引物进行反转录，用WSN-PA-F1/R1引物检测病毒mRNA水平，另一部分Uni 12引物进行反转录，用WSN-PA-F/R引物检测病毒vRNA水平。

2 结果

2.1 hnRNP H2蛋白抑制流感病毒聚合酶活性Western blot结果显示，转染的质粒均可检测到PB1、PB2、PA、NP和Flag-hnRNP H2蛋白（图1A）。在此基础上，过表达hnRNP H2蛋白后，流感病毒聚合酶活性显著下降（图1B）。表明hnRNP H2蛋白能够在流感病毒转录复制阶段发挥抑制作用。

图1 hnRNP H2蛋白过表达对流感病毒聚合酶的影响

2.2 hnRNP H2蛋白能够与流感病毒RNA发生相互作用在293T细胞上分别转染pCMV-N-Flag-hnRNP H2质粒和pCMV-N-Flag质粒，转染后12h，将A/WSN/1933以MOI 0.1感染细胞，细胞感染后24h，利用Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarosse磁珠进行CO-IP，结果显示，hnRNP H2蛋白共沉淀下来的流感病毒vRNA和mRNA均明显多于对照组（图2），说明hnRNP H2蛋白能够与流感病毒RNA发生相互作用。

图2 免疫共沉淀验证hnRNP H2蛋白与RNA相互作用

3 讨论

流感病毒在复制过程中，有大量的宿主蛋白参与其中，研究宿主蛋白与流感病毒之间的相互作用，能够深入阐明流感病毒的复制及致病机制，为抗流感药物的研发提供潜在靶标。流感病毒在细胞核内完成复制，核内一些蛋白蛋白会参与流感病毒复制，已有研究表明核内蛋白hnRNP K能够与流感病毒NS1蛋白相互作用而参与流感病毒复制过程；Ecco等研究发现核蛋白ANP32能够增强流感病毒聚合酶活性促进流感病毒复制；Chang等发现核内蛋白hnRNP A2/B1能够与流感病毒NP蛋白相互作用影响病毒复制。

本研究在细胞内过表达hnRNP H2蛋白后影响了流感病毒的复制，通过荧光素酶活性试验发现，hnRNP H2蛋白能够抑制流感病毒聚合酶的活性。hnRNP H2蛋白是一种RNA结合蛋白，在细胞内hnRNP H2蛋白与流感病毒核酸相互作用研究中发现，hnRNP H2蛋白能够与流感病毒RNA发生相互作用。这说明hnRNP H2蛋白可能通过与流感病毒的RNA结合而阻止核酸出核来发挥抑制流感病毒的作用，这将为抗流感病毒药物研发提供思路。