谭国辉，王泽行，王汝鑫，张月星，任梦凡，陈苏丹*

（河南科技大学园艺与植物保护学院，河南洛阳 471000）

本研究采用单因素和正交试验设计，在超声波提取紫叶李叶片总多酚工艺优化的基础上，测定紫叶李叶片总多酚提取物对DPPH·、·OH 和O2·的清除能力，为紫叶李的充分利用和发展提供理论依据。

1 试验材料及主要仪器

在2020 年7 月，于河南科技大学开元校区采取长势一致、无病虫害为害的紫叶李叶片。

所用试剂为没食子酸、无水乙醇、福林酚试剂（上海蓝季科技公司）、20%碳酸钠、DPPH（上海蓝季生物科技公司）、Vc、FeSO4溶液、水杨酸、双氧水、邻苯三酚、Tris-HCl、浓盐酸。所用主要仪器为HX-HH5A4 型恒温水浴锅（深圳市力通世纪科技有限公司）、可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、KQ-500B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Allegra TM64Centrifuge 型高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司）。

2 试验方法

2.1 紫叶李叶片总多酚物质提取

取一定量的紫叶李叶片冲洗干净，在干燥箱中40℃干燥至恒重。粉碎后过筛，经精密计算称得0.5g的细粉，放入100mL 三角瓶中，按相应的料液比加入相应体积分数的乙醇溶液，摇匀后用封口膜封住瓶口，然后放在恒温水浴锅中，在一定温度下提取一段时间，再进行超声提取，在高速冷冻离心机中离心，取上清液，得到紫叶李叶片多酚提取液。

2.2 没食子酸标准曲线的绘制

2.2.1 对照溶液的制备。量取0.5mL 福林酚试剂于10mL 容量瓶中，后取2mL 20%碳酸钠溶液与福林酚反应，最后定容至10mL。避光静置2h。

2.2.2 标准曲线绘制。参照高剑[7]的方法并做适当改动，得到回归方程y=1.2728x+0.0455，相关系数R2=0.9992。

2.2.3 总多酚得率的计算。按“2.1”方法制备紫叶李叶片多酚提取液，将提取液定容至50mL，精密量取该溶液1mL，置于10mL 容量瓶中，用体积分数为50%的乙醇进行定容。精确吸取1.0mL 溶液，再置于10mL 容量瓶中定容，在760nm 波长处测定吸光度，根据下式计算紫叶李总多酚得率，计算公式如下：

式中：ρ 为所供试验溶液中总多酚的质量浓度（g/L），V 为提取液的体积（mL），K 为总多酚提取液的稀释倍数，m 为提取所用紫叶李叶片的质量（g）。

2.3 单因素试验

2.3.1 料液比。按料液比为1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 分别加入50%乙醇，混合后，在恒温水浴锅中60℃下进行水浴提取40min，然后在500W 的功率下通过超声波提取40min，最后在8000r/min、25℃条件下离心15min。

2.3.2 乙醇体积分数。按料液比为1∶90 分别加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，混合后，在恒温水浴锅中60℃下进行水浴提取40min，然后在500W 的功率下通过超声波提取40min，最后在8000r/min、25℃条件下离心15min。

2.3.3 水浴提取温度。按料液比为1∶90 加入60%的乙醇溶液，混合后，在40、50、60、70、80℃下先进行水浴提取40min，然后在500w 的功率下通过超声波提取40min，最后在8000r/min、25℃条件下离心15min。

2.3.4 超声提取时间。按料液比为1∶90 加入60%的乙醇溶液，混匀之后，在40℃下先进行水浴提取40min，然后在500w 的功率下通过超声波提取20、30、40、50、60min，最后在8000r/min、25℃条件下离心15min。

2.4 正交试验

基于单因素试验条件的优化结果，通过L9（34）正交试验设计，在超声提取功率为500w 条件下，利用对乙醇体积分数、超声提取时间、水浴提取温度和料液比进行四个因素三组合水平的正交试验，确定了紫叶李叶片总多酚最佳超声辅助提取工艺条件，正交试验设计如表1 所示。

表1 紫叶李叶片总多酚提取的正交试验设计

2.5 紫叶李叶片对3 种自由基的清除能力测定方法

2.5.1 紫叶李叶片总多酚对DPPH·清除能力测定。使用狄科等[8]和杨艳等[9]中的研究方法并对其加以适当浓度调整，称取0.0099g 的DPPH，并用无水乙醇稀释至250mL。取不同质量浓度的总多酚溶液2mL 于试管内，分别加入制备的0.1mol/L 的DPPH 乙醇溶液2mL 于试管内。混匀后，在黑暗室温条件下反应30min，在517nm 波长处测量吸光度A1，测量0.1mol/L 的DPPH乙醇溶液2mL 和无水乙醇2mL 的混合液的吸光度A2，及不同质量浓度的总多酚溶液2mL 和2mL 无水乙醇混合液的吸光值A0，以Vc 作为阳性对照，DPPH·清除率（Y）计算公式（2）为：

2.5.2 紫叶李叶片总多酚对羟基自由基的清除能力测定。采用闫旭宇等[10]的方法并进行修改。称取0.0912g的7H2O·FeSO4、0.0829g 水杨酸，分别用无水乙醇定容至100mL。取不同质量浓度总多酚溶液2mL，依次加入2mL 浓度为6mmol/L 的硫酸亚铁、30%的过氧化氢和水杨酸溶液，避光反应30min，在4000r/min 的转速下离心10min，在510nm 波长下测定样液的吸光度，记为A1。用蒸馏水代替上述水杨酸溶液，按上述条件下反应，记为A2；用蒸馏水代替上述总多酚溶液，在上述条件下反应，记为A0。以Vc 作为阳性对照，同等条件下反应。根据公式计算清除率。羟基自由基清除率（Y）计算公式（3）为：

2.5.3 紫叶李叶片总多酚对O2·的清除能力测定。采用谢碧秀等[11]及张蕾等[12]的方法并进行修改。称取0.3153g 邻苯三酚于100mL 容量瓶中，用10.00mmol/L的盐酸定容，制成25.00mmol/L 溶液；0.2mol/L 的Tris溶液50mL 与0.2mol/L 的HCl 溶液21.9mL 混匀，稀释至200mL。于试管中分别加入0.05mol/L 的Tris-HCL溶液（pH 值8.2）4.5mL，置于25℃水浴20min。加入不同质量浓度的多酚溶液2mL 和25℃保温过的邻苯三酚（10mol/LHCl 配置）0.08mL，加入后快速摇匀，25℃恒温水浴4min 后，立即加入2 滴8mol/L 的HCl，终止反应，并测定325nm 波长下的吸光值，用Vc 作为阳性对照。O2·清除率（4）计算公式为：

3 结果与分析

3.1 紫叶李叶片总多酚提取的单因素试验结果

3.1.1 料液比对总多酚提取的影响。由图1 可知，随着料液比的减小，紫叶李叶片总多酚得率在1∶60～1∶80 相对平缓地增加，但当料液比到达1∶90 时，总多酚得率达到峰值，此时总多酚得率为2.56mg/g。当料液比超过1∶90 后，总多酚得率下降，可能是因为在1∶90 总多酚的溶解率达到饱和。故选取1∶90 为宜。

图1 料液比对紫叶李叶片总多酚得率的影响

3.1.2 乙醇体积分数对总多酚提取的影响。由图2 可知，紫叶李叶片总多酚得率在乙醇体积分数为30%～40%时上升较快，在乙醇体积分数为40%～60%时上升缓慢，当乙醇体积分数超过60%时，总多酚得率达到峰值，为2.03mg/g。继续提高乙醇体积分数，得率降低。在提取的溶液含量过高时，由于某些化合物如醇溶性杂质等成分溶出量增多，导致总多酚不易溶出，从而引起总多酚得率降低，还增加了成本，考虑到提取得率和成本，最后确定乙醇体积分数为60%为佳。

图2 乙醇体积分数对紫叶李叶片总多酚得率的影响

3.1.3 超声提取时间对总多酚提取的影响。由图3 可知，当超声波提取时间为20～40min 时，得率随着提取时间的延长而增加，当提取时间达到40min 时，最高为1.97mg/g。当提取时间超过40min 时，得率缓慢下降。这可能是因为总多酚具有多酚羟基，很容易被空气中的氧气氧化。长时间加热后会分解，得率降低。因此，最佳提取时间为40min。

图3 超声提取时间对紫叶李叶片总多酚得率的影响

3.1.4 提取温度对总多酚提取的影响。由图4 可知，当提取温度为30～40℃时，得率迅速增加，在40℃时达到最大值，为2.12mg/g。当提取温度超过40℃时，得率缓慢下降。但当提取温度过高时，总多酚的结构容易被氧化破坏，乙醇容易挥发。同时，杂质的溶解也会增加，导致总多酚的减少，得率下降。因此，最佳萃取温度为40℃。

图4 提取温度对紫叶李叶片总多酚得率的影响

3.2 紫叶李叶片总多酚提取的正交试验结果

由表2 中的极差R 数据分析得知，正交试验提取条件中的4 个因素，对总多酚物质提取率的影响程度依次为D＞A＞C＞B，即料液比＞乙醇体积分数＞水浴提取温度＞超声提取时间。从实测值差异显著性数据k1～k3可以得出，紫叶李中总多酚的超声最佳提取工艺条件参数为A2B2C2D1，即乙醇体积分数为60%、料液比为1∶80g/mL、水浴提取温度为40℃和超声提取时间为40min。对得到的最佳工艺提取条件进行验证试验，测得3 次总多酚得率的平均值为4.75mg/g，相对标准偏差RSD 为1.16%，表明此工艺是有效的。

表2 紫叶李叶片总多酚提取的正交设计及结果

3.3 紫叶李叶片总多酚对3 种自由基清除能力测定分析

3.3.1 紫叶李叶片总多酚对DPPH·清除率的测定结果。由图5 可知，紫叶李叶片总多酚和Vc 对DPPH·均具有一定清除效果，随着质量浓度的增加，清除率逐渐提高。当质量浓度大于0.03mg/mL 时，Vc 对DPPH·的清除率的上升趋势缓慢，0.03、0.04mg/mL 时，二者清除率分别增加8.5%和10.5%，紫叶李叶片总多酚上升趋势较Vc 快；当质量浓度为0.04mg/mL 时，二者对DPPH·的清除能力均达到顶峰，此时紫叶李叶片总多酚的清除率达到53.3%，Vc 的清除率达到72.7%。与同一质量浓度的Vc 相比，紫叶李叶片总多酚对DPPH·具有一定的清除能力。

图5 紫叶李叶片总多酚对DPPH·的清除作用

3.3.2 紫叶李叶片总多酚对·OH 清除率的测定结果。由图6 可知，紫叶李叶片总多酚和Vc 对·OH 的清除效果，都随着其质量浓度的增加而呈上升趋势。当质量浓度为0.04mg/mL 时，二者对·OH 的清除能力达到顶峰，紫叶李叶片总多酚的清除率达到70.7%，Vc 的清除率达到86.7%。与同等质量浓度的Vc 相比，紫叶李叶片总多酚对·OH 具有一定的清除能力。

图6 紫叶李叶片总多酚对·OH 的清除作用

3.3.3 紫叶李叶片总多酚对O2·清除率的测定结果。由图7 可知，当质量浓度为0.02mg/mL 时，紫叶李叶片总多酚和Vc 的清除率分别为70.0%和87.8%；质量浓度大于0.02mg/mL 时，紫叶李叶片总多酚和Vc 对O2·的清除能力趋于稳定上升。质量浓度为0.04mg/mL 时，二者对O2·的清除能力达到最大，紫叶李叶片总多酚的清除率为78.67%，Vc 的清除率为90.48%。与同一质量浓度的Vc 相比，紫叶李叶片总多酚对O2·具有良好的清除能力。

图7 紫叶李叶片总多酚对O2·的清除作用

4 讨论与结论

汪洪涛等[1]对紫叶李果实总多酚提取工艺的研究结果表明，在最佳工艺下提取的总多酚得率为18.13mg/g；高剑等[7]报道，紫叶李皮中总多酚在最优提取工艺下的得率为55.3mg/g；Song W[13]等测定紫叶李叶片中提取的总多酚得率为（117.8±8.8）mg/g，枝条中提取的总多酚得率为（100.04±1.9）mg/g；而本研究发现紫叶李不同部位的总多酚含量存在一定的差异，并且紫叶李总多酚的含量受栽培类型、提取方法、成熟度、生长环境、生长季节、生长地区等的影响。

茹巧美等[14]研究表明，紫苏叶多酚对DPPH·、·OH和O2·的IC50 分别为70.81，60.21，73.44μg/mL；李芬芳等[15]研究表明，当草莓多酚浓度为0.16mg/mL 时，对DPPH·的清除率达到93.33%，对·OH 抑制率达78.68%，抗超氧阴离子能力达165.16U/L；楚红英等[16]抗氧化试验结果表明,当金钱草多酚浓度为500μg/mL时，对DPPH·、·OH 和O2-·的清除率分别为68.3%、87.6%、88.0%。通过比较分析得出，紫叶李叶片多酚提取物具有良好的抗氧化能力，对O2·的清除能力较好，与同一质量浓度的Vc 相比，清除能力稍低，并且总多酚的抗氧化能力受多酚浓度、植物种类、提取方法和提取部位等的影响。这为紫叶李多酚的进一步研究及应用提供依据和参考。