周 伟，刘旭平,张艳敏,彭雯娟，赵 亮,,谭文松,

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2.上海倍谙基生物科技有限公司，上海 201203)

断奶后多系统衰竭综合征(post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)于1991年在加拿大西部首次被发现，此后在亚洲、欧洲、美国和墨西哥也相继被报道。 在20世纪90年代中期，猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)被确认为PMWS的病原体，也是所有主要养猪国最重要的病毒性病原体之一。感染PCV2后尚无有效治疗药物，只有通过提前接种疫苗进行预防。目前，商业化的猪圆环病毒疫苗主要有灭活疫苗和亚单位疫苗，另外还有部分新型疫苗尚处于试验研究阶段[1]。国内亚单位疫苗核心技术仍掌握在外企手中，导致价格居高不下，猪场普及率较低。PCV2灭活疫苗因具有安全、稳定以及价格便宜等优点，被众多养猪场采用。但是目前国内灭活疫苗抗原的主要生产方式仍然是滚瓶贴壁培养或微载体悬浮培养PK-15细胞增殖PCV2[2]。滚瓶贴壁培养和微载体悬浮培养均依赖于细胞的贴壁生长，放大规模受限；贴壁培养过程依赖动物源成分血清，增加了工艺成本，且易引起批间差异和污染。除此之外，贴壁培养无法对工艺过程进行实时监控，存在可重复性差的缺陷。截至目前国内在PCV2疫苗制备的无血清悬浮培养工艺上尚属空白，仍有较大的发展空间[3-6]。2011年中国农业部发布的1708号公告中明确指出滚瓶等传统方式生产的兽用疫苗生产线将停止受理GMP申请[7]。因此，开发高效的悬浮培养生产工艺对猪圆环病毒疫苗产业升级具有重大意义。

无血清悬浮培养工艺需有驯化成功的悬浮PK-15细胞株以及合适的培养工艺参数，故细胞驯化和工艺开发是工艺建立过程中的重要步骤。张瑞永等[8]通过驯化贴壁PK-15细胞适应低血清生长环境，成功建立了低血清培养工艺，病毒滴度达106.375TCID50/mL。华涛等[9]利用微载体培养PK-15细胞并优化微载体工艺参数，使病毒滴度达107.25TCID50/mL，但细胞贴附在微载体上需多次消化传代，增加了工艺复杂度，从而一定程度上限制了其工业化应用。

目前，国内多数PCV2疫苗生产仍以含血清工艺为主，且尚缺乏悬浮PK-15细胞株，规模放大受限，产品质量不稳定且生产成本偏高，间接导致国内猪场疫苗普及率较低。为了提高病毒产量，降低生产成本，本研究利用无血清悬浮培养PK-15细胞增殖PCV2，并对PCV2增殖的工艺参数和细胞代谢特性进行了初步研究，以期为建立工业化大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株与病毒株

PK-15细胞购自中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心；PCV2由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM培养基、无血清培养基Proli-S001S均购自上海倍谙基生物科技有限公司；胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自BIOSUN公司；葡萄糖试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司；乳酸和尿素氮试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；一抗Anti-PCV2 NC Monoclonal Antibody(JNT0301)购自MEDIAN公司；二抗荧光素标记的小鼠IgG抗体购自KPL公司。细胞培养方瓶与摇瓶购自Corning公司；二氧化碳培养箱(Heracell 150i)购自Thermo公司；轨道式摇床(OS-100)购自Allsheng公司；细胞计数仪(IC-1000)购自上海睿钰生物科技有限公司；生化分析仪(BP100PLUS)购自Nova公司；1260 HPLC系统和C18氨基酸分析柱均购自Aglient公司；倒置荧光显微镜(Eclipse 80i)购自Nikon公司。

1.3 PK-15细胞培养、驯化及驯化细胞的生长特性

1.3.1 PK-15细胞贴壁培养与无血清悬浮驯化 用DMEM+10% FBS培养基复苏PK-15细胞，待汇合度达到90%时进行传代，传代比例为1∶4。将培养2 d且细胞汇合度达到90%的贴壁PK-15细胞经0.25%胰酶消化成单个细胞后，终止消化并离心去上清，而后使用Proli-S001S培养基重悬并置于摇床上130 r/min振荡培养，驯化初期，需对培养体系进行沉降换液(4 ℃)以去除培养环境中的代谢副产物并补充新鲜培养基。 驯化后期，以1.0×106/mL细胞密度进行稀释传代。每隔1 d取样检测活细胞密度(viable cell density,VCD)和细胞活率(viability,Via)并计算每天细胞的比生长速率变化。使用0.4 g/L台盼蓝染色液与细胞液等比例混合(100 μL细胞液加100 μL染色液)，而后将混合液加入细胞计数板中，使用IC1000细胞计数仪计数，计算细胞活率与比生长速率。

Via=Xv/(Xv+Xd)×100%

式中：Xv表示活细胞密度(mL-1)；Xd表示死细胞密度(mL-1)。

式中：μ代表比生长速率(d-1)，Xv2和Xv1分别对应时间t2和t1时的活细胞密度(mL-1)，当μ>0时代表比生长速率，当μ<0时代表比死亡速率。Δt=t2-t1(d)。

1.3.2 悬浮PK-15细胞连续传代和生长曲线测定 悬浮PK-15细胞连续传代：取驯化成功且处于对数生长期的悬浮PK-15细胞，以1.0×106/mL的细胞密度接种于125 mL摇瓶中，培养体积为30 mL，每2 d取样检测活细胞密度和细胞活率并进行稀释传代，连续传代15次。生长曲线测定：批培养模式下，以1.0×106/mL的细胞密度接种于125 mL摇瓶中，培养体积为30 mL，每隔24 h取样，并检测活细胞密度和细胞活率,细胞密度和活率随时间变化曲线即为细胞生长曲线。

1.4 PCV2增殖条件摸索

1.4.1 感染复数摸索 取对数生长期的悬浮PK-15细胞，以1.0×106/mL接种于125 mL摇瓶中，培养体积为30 mL。分别按感染复数(MOI)为0.10、0.05、0.01和0.001换算出相应病毒液体积，在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。每隔24 h取样，检测活细胞密度、细胞活率，并在病毒感染后72 h留取无菌样，根据Karber法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID50)[10]。当TCID50最大时，其对应的感染复数即为最佳增殖条件。

1.4.2 细胞接种密度摸索 取对数生长期的悬浮PK-15细胞以1.0×106/mL(CDI-1)、3.0×106/mL(CDI-3)和5.0×106/mL(CDI-5)接种于125 mL摇瓶中，培养体积为30 mL。接种前均离心全量换液，并用新鲜培养基重悬。分别按最佳感染复数加入相应病毒液，在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。 每隔24 h取样，检测活细胞密度、细胞活率。在病毒感染后72 h留取无菌样检测TCID50。

1.5 病毒感染前后细胞代谢分析

1.5.1 病毒感染前后细胞代谢物差异分析 细胞接种病毒前(对照组)后(感染组)，在0、24、48、72、96 h取样，10 000 r/min离心5 min，取上清。用试剂盒检测培养过程中葡萄糖(Glu)、乳酸(Lac)和氨的浓度；以邻苯二甲醛-氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC)为衍生试剂对样品中的氨基酸进行在线色谱分析[11]。

1.6 数据统计分析

细胞密度、细胞活率、比生长速率、葡萄糖浓度、谷氨酰胺浓度、乳酸浓度和氨浓度结果用平均值±标准差表示，病毒滴度采用JMP13软件中的Turkey-Kremer进行均值的统计检验，氨基酸代谢速率结果采用JMP13进行独立样本t检验。用Origin pro 2017软件进行绘图。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 PK-15细胞的无血清悬浮驯化及其生长特性

2.1.1 PK-15细胞的无血清悬浮驯化结果 驯化期间细胞生长状态及比生长速率如图1所示。驯化初期活细胞密度为1.0×106/mL，比生长速率为0.1 d-1左右，但细胞活率>90%。驯化中期，细胞逐渐适应Proli-S001S培养基，活细胞密度较驯化初期明显提高，且细胞活率仍然>90%，在此期间细胞比生长速率由0.1 d-1缓慢增加到0.3 d-1。驯化后期，细胞比生长速率由0.3 d-1逐渐增加至0.6 d-1，且生长状态较为稳定。说明经过30 d的直接驯化，PK-15细胞能够完全适应无血清悬浮培养体系。

2.1.2 驯化PK-15细胞的生长特性 由图2A可知，悬浮PK-15细胞每2 d传1代，代次之间细胞生长稳定，传15代次未出现明显的生长衰减，且传代过程中细胞活率始终维持在90%以上。由图2B可知，以1.0×106/mL接种后峰值活细胞密度在第4天出现，可达6.2×106/mL，且在第4天之前，细胞活率均>90%，但在峰值活细胞密度下仅能维持1 d左右，第4天后活细胞密度与细胞活率均开始快速下降。

图1 PK-15细胞驯化过程中生长状态(A)和比生长速率(B)变化情况Fig.1 Changes of growth status (A) and specific growth rate (B) of PK-15 cells during acclimation

图2 悬浮PK-15细胞传代稳定性(A)和生长(B)情况Fig.2 Passage stability (A) and growth (B) of suspension cultured PK-15 cells

2.2 PCV2在无血清悬浮培养PK-15细胞上增殖条件摸索

2.2.1 不同感染复数对PCV2增殖影响 由图3A可知，在感染后0～24 h，各组细胞生长状态相似，细胞生长幅度接近。在感染24 h后，随着感染复数的降低，活细胞密度升高。各组活细胞密度均在感染72 h附近达到峰值，随后活细胞密度开始下降。细胞活率在感染48 h附近开始低于90%。由图3B可知，当感染复数为0.05时，最终收获的病毒滴度可达到最大，为105.8TCID50/mL。因此后续试验感染复数均采用0.05。

2.2.2 不同细胞接种密度对PCV2增殖影响 在最佳感染复数为0.05的基础上考察不同细胞接种密度对病毒增殖的影响。由图4A可知，当细胞接种密度为1.0×106/mL时，在感染后72 h内细胞仍能维持生长，细胞活率缓慢下降。感染72 h后活细胞密度及活率快速下降。3.0×106/mL和5.0×106/mL组在感染24 h后细胞密度和活率开始快速下降。由图4B可知，增加细胞接种密度并不能有效地提高PCV2滴度，最佳细胞接种密度为1.0×106/mL，此时病毒滴度可达106.2TCID50/mL。

肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below图3 不同感染复数组细胞生长(A)和PCV2增殖(B)情况Fig.3 Cell growth (A) and PCV2 proliferation (B) in different MOI groups

图4 不同细胞接种密度组细胞生长(A)和PCV2增殖(B)情况Fig.4 Cell growth (A) and PCV2 proliferation (B) in different CDI groups

2.3 病毒感染前后细胞代谢分析

2.3.1 病毒感染前后细胞代谢物差异 由图5可知，随着培养时间的延长，对照组葡萄糖和谷氨酰胺浓度逐渐降低，同时伴随相应代谢副产物乳酸和氨的生成(图5A)。与对照组相比，感染组环境中各物质浓度变化明显加快，在72 h附近感染组出现了葡萄糖和谷氨酰胺耗竭，且乳酸由生成转为消耗(图5B)。通过对比可发现，在96 h时，感染组中副产物氨浓度高于同期对照组约 5 mmol/L。

图5 细胞感染病毒前(A)后(B)代谢差异对比Fig.5 Comparison of metabolic differences before (A) and after (B) cell infection with virus

2.3.2 病毒感染前后细胞代谢速率差异 由表1可知，在0～24 h，感染组细胞对葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的比消耗或比生成速率分别提高了127.8%、139.9%、355.1%和294.8%。 在24～48 h葡萄糖和谷氨酰胺作为能源物质仍然被快速消耗，然而除葡萄糖外2组细胞对乳酸、谷氨酰胺和氨之间的差异有明显下降。在48～72 h期间，葡萄糖、谷氨酰胺和氨的代谢速率差异进一步缩小，但乳酸代谢途径开始发生变化。在72～96 h，对照组细胞代谢速率快于感染组，且乳酸代谢速率差异进一步扩大。

由图6可知，与对照组相比，感染组细胞对各氨基酸代谢速率均显著加快，Asn、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Val、Met、Trp、Ile和Leu的比消耗速率分别比对照组提高了39.9%、114.4%、36.4%、411.9%、78.1%、42.7%、132.7%、160.9%、84.5%、81.3%、126.4%和126.8%，而Asp、Glu和Lys呈现出完全相反的代谢特性，对照组表现为细胞消耗，而感染组则出现生成。Ala在2组细胞中表现出代谢同向性，且对照组细胞代谢速率大于感染组。感染组和对照组细胞对Cys和Phe代谢速率非常接近。

表1 不同时间段感染病毒前后细胞对葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的代谢速率变化

**,差异极显著(P<0.01)**,Extremely significant differences (P<0.01)图6 细胞感染病毒前后氨基酸代谢速率Fig.6 Metabolism rate of amino acids before and after cell infection with virus

3 讨 论

在动物细胞无血清悬浮培养生产PCV2过程中，悬浮细胞的驯化、生产工艺参数以及培养过程的各营养物代谢等因素均会对病毒增殖产生影响。细胞作为生产全过程的起点，对工艺过程的培养模式及生产能力具有决定性作用。刘天伦等[12]通过梯度降血清连续传代驯化贴壁PK-15细胞，驯化期间共采用3种培养方法，共需传代23次。本研究采用直接驯化法，无需逐步替代培养体系，且驯化过程仅耗时30 d，过程操作较为简便。闪伊红等[13]用微载体培养PK-15细胞增殖PCV2，种子细胞扩增过程需微载体、血清及胰酶等额外的试剂和耗材，并且当反应器规模增大时，种子贴壁扩增阶段的规模也会大大增加，对工艺过程提出了更大挑战。本研究结果表明，无血清悬浮培养具有较高的活细胞密度及生长速率，规模放大过程仅需线性放大培养体积即可，操作简便且染菌风险大大降低。 说明悬浮PK-15细胞株在操作过程及规模放大过程中均有非常明显的优势。

病毒生产工艺过程涉及多个工艺参数的影响，其中感染复数和细胞接种密度的确定对工艺至关重要。梁武等[14]通过对工艺参数的摸索和优化发现，当感染复数为0.5、细胞接种密度为0.5×106/mL时，病毒滴度可达到最大。邱贞娜等[15]在贴壁培养工艺上针对性考察了细胞密度对PCV2增殖的影响，发现最佳细胞接种密度为1.5×105～2×105/mL。本研究结果表明，最佳感染复数为0.05，最佳细胞接种密度为1.0×106/mL。与上述研究出现不同结果，其原因可能是细胞株、病毒株、培养基及培养模式之间存在较大差异。有研究报道，PCV2复制增殖依赖于宿主细胞分裂的S期[16]，本研究中高感染复数下观察到细胞生长受到抑制且病毒滴度较最佳感染复数有所下降，推测可能与细胞生长受到影响有关。而较低的感染复数下会出现多数细胞并未被感染，且后期细胞裂解或因病毒感染产生抗病毒物质又易造成细胞资源的浪费。基于悬浮培养工艺，发现最佳细胞接种密度为1×106/mL，较贴壁培养大幅提高[17]，这可能得益于悬浮培养体系下可使细胞和病毒有效碰撞几率大大增加。另外，本研究发现细胞接种密度与病毒滴度呈负相关，分析原因可能是因为PCV2体外复制效率较低，其增殖随宿主细胞生长而进行，导致病毒复制周期较长[18-19]，环境中部分细胞并未被PCV2感染。工艺参数对最终病毒产量有很大影响，其摸索和优化是工艺建立过程必不可少的环节。

葡萄糖、氨基酸等营养物质代谢和乳酸、氨等代谢副产物积累对于细胞生长及产物滴度具有重要影响。贾涵婧[20]开发了流感疫苗的流加培养工艺，从而大幅提高了培养过程的细胞密度，同时解决了营养物限制及代谢副产物累积等问题。本研究通过细胞代谢研究发现，在培养后期感染组的培养环境开始出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭，细胞开始代谢乳酸，而对照组中未发现此类现象，推测可能是病毒感染后细胞代谢途径发生较大变化[21]。同时感染组和对照组均出现副产物氨快速积累，因此或许可以进行补料工艺以及灌流培养工艺的探索从而更新培养液营养以获得更高的病毒产量[22]。糖酵解速率加快往往伴随副产物乳酸初期大量生成，研究表明，氨和乳酸的积累对细胞不利，恶化培养后期细胞生长环境[23]。本研究中，乳酸在感染组的后期被完全消耗，从能量代谢角度推测可能与病毒增殖呈正相关[24]，但对照组中培养初期大量生成乳酸却是一个不好的信号，同时和批培养过程结合分析，可以推测后期细胞活率快速下降可能与此有关。在培养后期，感染组中氨浓度已接近于7.0 mmol/L，远高于同期细胞培养抑制上限，因此可以继续优化细胞代谢途径或培养基组分进而减小代谢副产物的生成。氨基酸作为细胞培养非常重要的一类营养物质，其代谢情况对细胞生长和产物表达具有直接影响。本研究对氨基酸代谢分析发现，细胞感染病毒后多数氨基酸代谢速率显著加快。Tyr代谢兼具生糖和生酮功能，为细胞代谢的重要营养物质[25]；病毒核酸与蛋白的合成不仅需要葡萄糖提供能量以及合成蛋白的基本元件氨基酸，同时也需要Ser、His和Met等能提供一碳单元的氨基酸[26]。另外，病毒也会诱使胞内发生各种抗(促)病毒反应，如加速Gly和Glu合成谷胱甘肽增强抗氧化反应等[27]，此类反应需要上百种细胞因子和蛋白酶类参与[28]，会进一步加大细胞对能量、碳源和氮源的需求[29]。因此，深入了解细胞代谢需求进而优化营养环境可进一步提升工艺经济性。

4 结 论

经过30 d的直接驯化，可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于增殖PCV2，最终病毒滴度可达106.2TCID50/mL，本研究结果为无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础，也为国内疫苗产业工艺升级提供一定的借鉴。