董兆威 田茂颖 赵毅萌 王超 王汉夫 王瑾 黄勤挽

摘要 目的：探討外观性状与内在质量相关联的黄连药材量等级评价方法和标准。方法：以市场收集的18批黄连药材为研究对象，构建外观性状与内在质量相关联的黄连的质量等级评价手段。对18批黄连药材进行了水分、灰分、浸出物、长度、直径、小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量和色度检测;运用主成分分析、相关性分析、方差分析等多种数理统计手段，筛选分级指标，进行黄连等级划分研究。结果：经筛选认为长度、浸出物和小檗碱含量为黄连品质评价的关键指标，且外在指标（长度）与内在质量（浸出物和小檗碱含量）在0.01水平上呈显著性正相关，结合市场实际情况，制定了黄连一等、二等、统货的质量等级标准。结论：该质量等级不仅从外观特性上对黄连药材进行了等级评价，同时也在其内在质量差异上进行了表征，补充了现有团体标准的不足，也为后续行业标准或国家标准的建立提供依据。

关键词 黄连;外观性状;内在质量;质量等级

Grading of Rhizoma Coptidis Based on Appearance Trait and Intrinsic Quality Correlation and Multivariate Statistical Analysis

DONG Zhaowei1，TIAN Maoying1，ZHAO Yimeng1，WANG Chao2，WANG Hanfu3，WANG Jin1，HUANG Qinwan1

（1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China; 2 Sichuan Integrative Medicine Hospital，Chengdu610042，China; 3 Sichuan Limin Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces Co.Ltd.，Chengdu 611331，China）

AbstractObjective： To investigate the evaluation method and standard of the quantity rating of Huanglian medicinal materials related to the external traits and intrinsic quality. Methods： To construct a method for evaluating the quality grades of Rhizoma Coptidis based on correlation between appearance traits and intrinsic quality by using 18 batches of commercially available Rhizoma Coptidis.Eighteen batches of Rhizoma Coptidis were tested for moisture，ash，extractum，length，diameter，berberine content，epiberberine content，coptisine content，palmatine content and chromaticity.Mathematical and statistical tools such as principal component analysis（PCA），correlation analysis and analysis of variance were used to screen the grading indexes. Results： Length，extractum and berberine content were considered as the key indexes for the quality evaluation of Rhizoma Coptidis，and the extrinsic index（length） and intrinsic quality indexes（extractum and berberine content） were positively correlated at 0.01 significance level.Finally，the standards of first grade，second grade and general grade quality of Rhizoma Coptidis were developed in combination with the actual market situation. Conclusion： The quality grades not only evaluated Rhizoma Coptidis in terms of appearance characteristics，but also characterized it in terms of intrinsic quality differences，which made up deficiencies for the existing group standards and also provided the basis for establishing subsequent industry standards or national standards.

Keywords Rhizoma Coptidis; Appearance traits; Intrinsic quality; Quality gradesAEC2C78E-E1B4-4A27-9936-26B9DBE299F8

中图分类号：R282 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.004

黄连为毛茛科植物黄连（ Coptis chinensis  Franch.）、三角叶黄连（ Coptis deltoidea  C.Y.Cheng et Hsiao）或云连（ Coptis teeta  Wall.）的干燥根茎，分别习称“味连”“雅连”和“云连”[1]。其具有清热燥湿，泻火解毒的功效，可用于细菌性痢疾、糖尿病、溃疡性结肠炎等疾病[2-4]。由于云连产量极小，雅连资源稀缺，现在中药材市场上流通的黄连品种主要为味连[5]。重庆石柱和湖北利川是味连的道地产区，在四川洪雅、峨眉，彭州、大邑等地也有產区[6]。

中药饮片和中成药的疗效与中药材的质量密切相关，因此中药材优劣与否是影响临床上中药安全性及有效性的关键。自古以来中药材都是“看货评级，分档议价”，药材分等后有利于分档议价售出，对于中药材市场的健康发展具有重要的意义[7]。此外患者还可以根据自己的经济情况选择不同等级的药材，所以对中药材进行等级划分十分必要。随着历史发展，各种药材的等级区分方法在中药市场中不断演变，具有简易、快捷的特点。虽然这种传统方法可以直观地判别出中药外观性状与品质价值的联系，但需要依靠丰富的经验。随着药材需求量增加以及专业药工人才短缺，这种传统方法逐渐消失[8]。为了解决药材等级标准粗糙、老化滞后等问题，不少研究者对中药材商品规格等级外观指标与内在指标评价进行了研究，分析其等级间质量差异、外观性状与其内在指标成分含量的相互关系，制定中药材商品规格等级标准，在五倍子、西洋参、车前子中已有报道[9-11]。张明智等[12]采用电子舌技术量化黄连味觉信息并考察其与总生物碱的相关性，发现不同等级黄连总生物碱含量与其味觉信息负相关，对黄连等级分类贡献不大，也未体现外观特性与内在质量之间的相关性。

历来本草典籍均称黄连“味极浓苦”“黄肥坚者”为佳，即是现代分类手段中所说的长度、直径、颜色与味道[13]。中华中医药学会发布的《中药材商品规格等级 黄连》中利用长度和直径将黄连药材分为一等品、二等品和统货，能够直观地反映黄连的商品等级，具有很强的应用价值，但是未涉及黄连的内在品质评价[14]。黄连的味道与其生物碱含量有关，可以初步将其作为内在指标，而颜色要通过色彩色差计判断。色彩色差计是通过模拟人眼对颜色的判断，得到样品颜色的3个刺激值X、Y和Z，再根据国际照明委员会Lab颜色空间原理计算得出色差值明度（L*）、红绿色轴分量（a*）、黄蓝色轴分量（b*）（其中，“+a*”表示红色，“-a*”表示绿色;“+b*”表示黄色，“-b*”表示蓝色）[15-16]，最后通过L*、a*、b*将颜色准确量化。因得到的数据繁杂，需要以多元数理统计手段综合筛选黄连品质评价的关键指标。结合实际应用情况，现构建黄连外在性状与内在质量相关的质量等级标准，为市场上黄连的品质评价提供一定的参考方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药物

样品共收集18批黄连药材，分别来自四川省大邑县6批、四川省峨眉山市6批、重庆石柱县6批，经成都中医药大学黄勤挽教授鉴定均为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis  Franch的干燥根茎。

1.1.2试剂

乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich，批号：WXBD4324V）、十二烷基硫酸钠（色谱纯，成都市科隆化学品有限公司，批号：2017072401）、磷酸二氢钾（色谱纯，成都市科隆化学品有限公司，批号：201604280）、盐酸小檗碱对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17110502）

1.1.3仪器

高速离心机（无锡瑞江分析仪器有限公司，型号：RJ-TGL-16C）、超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-300E）、型超纯水器（都优普超纯科技有限公司，型号：UPH-1-10T）、电子天平（北京赛多利斯天平有限公司，型号：BS200S）、电子天平（上海越平科学仪器有限公司，型号：YP3002）、电热恒温鼓风干燥箱（上海将任实验设备有限公司，型号：DHG-9240）、循环水式真空泵[巩义市予华仪器有限责任公司，型号：SHZ-D（Ⅲ）]、岛津高效液相色谱仪（岛津公司，日本，型号：LC-2030C3D）、Wondasil C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，GL Sciences公司，日本，型号：8J3706-20）、pH计（上海仪电科学股份有限公司，型号：PHS-3C）、高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司，型号：Q-400B）、电子数显游标卡尺（成都成量工具集团有限公司，型号：ZM208-1）、色彩色差计（KONICA MINOOLITA SENSING INC，型号：CR-410）。

1.2方法

1.2.1检查项测定

对18批黄连药材样品的水分、总灰分、浸出物进行测定。其中，水分按2020版《中华人民共和国药典（四部）》“0832水分测定法”项下第二法（烘干法）测定;总灰分按2020版《中华人民共和国药典（四部）》“2302灰分测定法”项下测定;浸出物按2020版《中华人民共和国药典（四部）》通则“2201浸出物测定法”进行测定。

1.2.2长度和直径的测量

随机选取每批黄连药材样品的50根，用游标卡尺测定50根黄连的长度和直径，计算平均值，记录数据。

1.2.3黄连生物碱含量测定

按照2020版《中华人民共和国药典（一部）》黄连项下相关方法，采用高效液相色谱法（通则0512）测定各批次药材中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量。AEC2C78E-E1B4-4A27-9936-26B9DBE299F8

1.2.4黄连色度检测

分别取18批黄连药材粉末，将样品粉末置于色彩色差计中，测定样品粉末颜色，每样品平行测定3次，取平均值。颜色数据统一用L*、a*、b*色空间表示，并通过公式E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2，计算出各样品的总色值。其中△E*为总色值，L*为亮度，a*和b*为色度坐标。

色彩色差计测定条件为光源D65，标准观察角度2°，照明口径50 mm。经白板校准，以L*=100、a*=0、b*=0为参照校正色[17]，测得各样品的L*、a*、b*。并且依次进行精密度、样品稳定性和不同光照强度的稳定性考察。

1.2.5统计分析

采用SPSS 26.0及Origin 9.0软件进行数据分析，采用描述统计、主成分分析、相关性分析及方差分析筛选分级指标，用K-聚类分析获得等级划分的聚类中心值， 制定黄连药材等级划分的标准。

2结果

2.1黄连外观性状与内在含量的数据结果

18批黄连药材水分、灰分、浸出物、小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量、长度、直径及色度结 果见表1。18批黄连药材水分为10.62% ～13.44%、灰分为2.18% ～2.89%，浸出物为21.78% ～28.83%，小檗碱含量为5.99% ～9.27%，表小檗碱含量为0.82% ～0.56%，黄连碱含量为1.59% ～2.77%，巴马汀含量为1.62% ～2.48%，长度为33.819 9mm～62.588 4 mm，直径为7.046 0 mm～10.058 7 mm，ΔE*为13.89～16.57。

2.2色彩色差计方法学考察

2.2.1精密度考察

取SZ-1黄连药材样品粉末适量，置于色彩色差计中，在同一时间内按“1.2.4”重复测量6次，结果考察仪器精密度，其L*（YC1）、a*（YC1）、b（YC1）的RSD值分别为0.09%、0.10%、0.15%，本方法精密度良好。

2.2.2样品稳定性考察

取SZ-1黄连药材样品粉末适量，置于色彩色差计中，按“2.3.1”项下测定条件连续5天在同一时刻测定样品色差值，考察稳定性，其L*（YC1）、a*（YC1）、b*（YC1）的RSD值分别为0.10%、0.12%、0.11%，药材粉末稳定性良好。

2.2.3不同光照强度的稳定性考察

取SZ-1黄连药材样品粉末适量，置于色彩色差计中，按“2.3.1”项下测定条件分别于同日内9：00、11：30、14：00、16：30、19：00时连续测定样品色差值，共5次。其L*（YC1）、a*（YC1）、b*（YC1）的RSD值分别为0.09%、0.31%、0.89%，不同光照强度对试验结果稳定性影响较小。

2.3分级指标的筛选

2.3.1指标成分数据统计描述

将得到的18批次黄连药材的数据资料水分、灰分、浸出物、小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量、长度、直径及△E*进行整理和归纳，进行统计描述。变异系数大的指标，说明在组间的差异较大，可作为黄连质量分级的依据。根据统计描述可知，小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量、长度和直径变异系数较大，可考虑作为分级指标。见表2。2.3.2主成分分析

10个指标综合评定时，指标之间通常存在信息不统一或重复等众多因素，故为达到客观全面地综合评价的目的，引入主成分分析法进行降维，利用SPSS 26.0将水分、灰分、浸出物、长度、直径、△E*、小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量进行主成分分析，其中KMO取样适切性量数为0.611>0.5，巴特利特球形度检验显著性<0.01，主成分分析有意义。见表3。第一主成分的特征根为4.681，第二主成分特征根为2.237，第三主成分特征根为1.122。见图1。第一主成分已经能比较全面反映所有样本的信息，根据特征向量的大小可得到各指标对于主成分贡献的大小。从第一主成分中可以得到长度、直径、浸出物、小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量的特征向量均>0.50，故长度、直径、浸出物、小檗碱含量、表小檗碱含量、黄连碱含量、巴马汀含量可作为划分黄连药材等级的重要参考指标。

2.3.3指标相关性分析

因表小檗碱含量、黄连碱含量和巴马汀含量是由2020版《中华人民共和国药典》中一测多评法测得，与小檗碱含量具有内在联系，故将小檗碱含量和浸出物看作是评价黄连品质优劣的内在质量指标，制定质量等级需要寻求外观性状与内在质量的相关性，故利用Origin 9.0软件将18批药材的7个指标进行两两相关的Pearson相关性分析。图中的数字为两指标间的显著性参数，数值为正数即正相关，数值为负数即负相关。长度与黄连内在质量（浸出物与小檗碱含量）在0.01水平上具有显著正相关性，水分、灰分和直径与内在质量无显著性关系。见图2。

通过主成分分析、相关性分析的结果，认为长度是和浸出物与小檗碱含量有显著相关的外观指标，同时长度、浸出物和小檗碱含量也是能够评价黄连品质的重要指标，故将这3个指标列为最终黄连药材的等级划分指标。

2.3.4方差分析

为进一步验证选择指标的准确性，运用SPSS 26.0對分级指标——长度、浸出物和小檗碱含量进行方差分析。通过方差分析结果可得长度的差异性达到极显著水平（ P <0.01），而浸出物和小檗碱含量也达到显著性水平（ P <0.05）。方差分析的结果进一步佐证了长度、浸出物和小檗碱含量可作为黄连药材分级指标的合理性。见表4。

2.3.5等级划分

利用Origin 9.0软件将分级指标长度、浸出物和小檗碱含量进行K-均值聚类，将黄连分为3类，其中1类共3批、2类共9批、3类共6批。见图3。黄连药材规格等级的K-均值聚类法的最终聚类中心值见表5。AEC2C78E-E1B4-4A27-9936-26B9DBE299F8

长度越长，浸出物也越多，有效成分的含量也越高，成正相关。以K-聚类中心值，结合行业内药材分级情况和实际应用的可行性，拟定黄连药材等级划分标准。见表6。

3讨论

3.1分级指标的合理性

黄连药材是黄连植株的根茎，随着生长年份的提高，黄连根茎的质量、数量和长度都会有一定程度的增加，相应的干物质积累与生物碱含量也有增多[18]。外观是否粗壮饱满是历代本草所推崇的黄连优劣等级鉴别要点，其主要体现在长度与直径上。本研究发现，直径与长度呈显著相关性（ P >0.05），这说明在黄连根茎生长的过程中，直径的增加也同时伴随着长度的增加。另外，长度与黄连内在质量（浸出物含量与小檗碱含量）在0.01水平上呈显著性正相关，且长度越长，浸出物也越多，有效成分小檗碱的含量也越高。但是，直径与黄连的内在质量无显著性关系，这应该与现代黄连种植中的人工施肥有关，将本不易产生区别的根茎宽度差距降到更低[19]。此外，研究发现不同批次黄连药材之间的色度数据并不是主要的分类指标，其与黄连内在成分小檗碱之间也并不具有显著性关系。黄连的颜色源于其生物碱，古人也称“色黄者佳”，我们猜测虽然各批次间的生物碱存在差异，但是生物碱的量变并没有引起颜色的质变，因此其微小差异并没有统计学意义。总的来说，结果与黄连传统评价分级规律“粗壮者佳”相一致，体现了研究工作的合理性。

在内在指标方面选择了浸出物和小檗碱含量，浸出物反映了药材中所含物质的多少，可以间接反映出黄连中活性成分的含量。有研究表明，黄连中的主要成分为生物碱类，主要包含小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱等，其中含量最高、研究最多且应用最广泛的是小檗碱[20-21]。2020版《中华人民共和国药典》中也以小檗碱为指标成分进行含量测定，并通过一测多评法计算表小檗碱、黄连碱、巴马汀的含量，因此后3种生物碱的含量与小檗碱间存在一定的相关性。但是有文献发现，由于光照时间、土壤及气候环境的差异，不同产地间黄连的生物碱比例也略有不同，即可能有产地1中的黄连碱含量高于产地2，但巴马汀含量相差不多[22-24]。小檗碱与黄连的药效作用具有高度相关性，可作为体现黄连内在品质质量的重要指标。因此，本研究选择了浸出物和小檗碱作为评价黄连药材的内在因素。故本研究既顺应了已有的标准内容，同时也在黄连等级中体现了药效功能的重要性。

3.2等级划分的科学性

本研究利用多种数理统计方法对10个分级指标进行逐步筛选，主成分分析法可以对数据达到降维的作用，在多指标研究时优选出更有价值的指标因子;Pearson相关性分析可以得到两变量之间的线性关系，构建外观性状与内在质量的关联性。使用多元统计方法，可以得到数据之间更多的关系，使得分析结果更具说服力和合理性。根据K-均值聚类结果，可以发现长度越长，浸出物越多，有效成分小檗碱含量也随之增多。经观察发现，内在成分较高的黄连，外形较含量低的黄连更加粗壮， 且有明显的长度差异，说明分析所得的等级划分标准与实际情况出入不大，结果具有较高的科学性，同时也方便日常的分级工作。本研究将黄连划分为一等品、二等品和统货共3个等级，不仅能顺应2020版《中华人民共和国药典》黄连项下的描述和规定，也满足历代本草对黄连质量的判断标准，体现了以长度为核心的外观性状与内在质量的关联性，同时将等级指标进行了量化和细分，以期在市场流通过程中能实现高效、准确、可操作性强的等级评价。

3.3评价模式的可参考性

本研究从药材品质出发，建立符合现代化药材分级的方法，相较于传统的药材商品规格等级分类而言，增加了浸出物和小檗碱含量测定为指标成分的等级标准，并将能够体现该药材品质质量的外在性状与内在质量进行相关联的等级区分，故该评价模式不仅从外观特性上对药材进行了等级评价，后续可收集更多批次样品进行深入验证，这同时也在其内在质量差异上进行了表征，补充了现有团体标准的不足，也为后续行业标准或国家标准的建立提供依据。在未来的药材分级过程中，可以凭借外观特征为导向初步对药材进行分级筛选，再进行深入的内在指标质量评价，以期更加全面、准确地体现不同等级中药材的质量差异。

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（2022-03-10收稿本文编辑：魏庆双）

基金项目：四川省中央引导地方科技发展专项项目（2021ZYD0109）;四川省中医药管理局课题（2021MS183）;四川省中医药标准化研究项目（2020019）作者简介：董兆威（1998.12—），男，硕士研究生在读，研究方向：中药炮制与物质基础，E-mail：1226802891@qq.com通信作者：黄勤挽（1979.10—），男，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：中药炮制，E-mail：huangqinwan@cdutcm.edu.cnAEC2C78E-E1B4-4A27-9936-26B9DBE299F8