吴灵丹，陈 洁，王资懿，徐柒华

0引言

外伤性增生性玻璃体视网膜病变(traumatic proliferative vitreoretinopathy，TPVR)是开放性眼外伤的一种常见并发症，其本质是过度的眼内创伤修复反应，在视网膜前后形成具有收缩能力的纤维膜，最终牵拉视网膜造成视网膜脱离，目前临床上无有效的抑制方法。手术可以去除增生的组织，但是不能抑制细胞增殖，导致治疗后复发率高[1-2]。目前临床和基础研究中已有多种药物被用于治疗TPVR，如皮质类固醇、抗代谢类药物、维生素、中药提取物等。曲安奈德(triamcinolone acetonide，TA)作为临床上抑制TPVR发展的药物已得到广泛认可，但临床使用中发现玻璃体腔注射TA后容易导致眼压升高及白内障等不良反应[3]。最新研究表明中药提取物青蒿琥酯(artesunate，ART)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗增殖作用[4-7]。另有研究发现，木犀草素(luteolin，LU)与一些免疫调节和抗炎作用有关，可抑制炎性细胞活化、炎症介质及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成[8]，其在眼科具有抗氧化，保护视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞及抗肿瘤作用[9-10]，可作为治疗眼部疾病的一种潜在选择。寻找能够有效防治TPVR且对眼部毒性作用较小的药物尤为重要，因此本研究主要观察上述三种药物在防治TPVR中的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康成年青紫蓝兔48只，6～8周龄，体质量2.0～2.5kg，饲养环境室温10℃～25℃，湿度50%～75%。实验前均行双眼裂隙灯及直接检眼镜检查，保证双眼无眼部疾病。本研究经南昌大学附属眼科医院医学研究伦理委员会审核批准(审批号：YLP202103005)。

1.1.2主要试剂和仪器曲安奈德1mg/mL(H20033525，浙江仙琚制药股份有限公司)，木犀草素10μg/mL(MUST-18102605，成都曼特斯生物科技有限公司)，青蒿琥酯20μg/mL(418A024，北京索莱宝科技有限公司)，盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔康有限公司)，加替沙星眼用凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司)，左氧氟沙星滴眼液(万汉制药有限公司)，氟米龙滴眼液(参天制药有限公司)，蛋白酶抑制剂(士德生物工程有限公司)，PBS(美国Hyclone公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，SDS裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，蛋白酶抑制剂混合物(北京普利莱基因技术有限公司)，α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(西格玛奥德里奇贸易有限公司)，波形蛋白(vimentin，VIM)(西格玛奥德里奇贸易有限公司)，GAPDH(诺伦生物科技有限公司)，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，PVDF膜(美国Promega公司)，免疫印迹检测试剂盒(美国Advan-sta公司)，眼球固定液(G1109，Servicebio)。眼底照相机(尼德克医疗器械贸易有限公司)，眼部B超机(德国Aviso公司)。

1.2方法

1.2.1富含血小板的血浆制备以注射器抽取兔耳动脉血5mL注入含3.8%枸橼酸钠的玻璃离心管(血与枸橼酸钠体积比9∶1)，轻轻摇动混匀，室温离心10min(1500r/min)，取1/3体积上清液，进行血小板计数，获得血小板密度(1.9～2.8)×108/mL的血浆[11]。

1.2.2TPVR动物模型制作及分组将48只青紫蓝兔随机分为对照组、TA组、ART组、LU组，每组12只，均以右眼为实验眼。术前3d，术眼滴左氧氟沙星滴眼液，每天4次。用盐酸丙美卡因滴眼液进行表面麻醉，开睑器开睑，聚维酮碘注射液冲洗术眼结膜囊，采用15度刀刺向玻璃体中心部，造成长约3mm的巩膜穿通伤，抽吸0.3mL玻璃体液后注入等量富含血小板的血浆，随后对照组玻璃体腔内注射0.1mL生理盐水，TA组玻璃体腔内注射0.1mL(1mg/mL)曲安奈德，ART组玻璃体腔内注射0.1mL(20μg/mL)青蒿琥酯，LU组玻璃体腔内注射0.1mL(10μg/mL)木犀草素。玻璃体腔注药后1wk内，给予左氧氟沙星滴眼液及氟米龙滴眼液预防感染。本研究药物注射浓度参考既往文献[8，12-13]中的实验数据。

1.2.3玻璃体及视网膜观察术后1、2、3、4wk，复方托吡卡胺散瞳后，通过眼底照相、眼部B超观察并记录各组兔眼玻璃体及视网膜改变情况。TPVR分级评定标准[14]：(1)0级：玻璃体基本透明，未见明显异常；(2)1级：玻璃体内形成增生条索，未见牵引；(3)2级：视网膜前可见膜状物形成，可见局部牵引，未见视网膜脱离；(4)3级：后极部视网膜可见褶皱，可有局部视网膜脱离；(5)4级：大范围视网膜脱离(包括后极部、周围视网膜脱离)；(6)5级：视网膜皱缩，增生条索牵拉视网膜脱离，可见裂孔。

1.2.4WesternBlot法检测玻璃体液中α-SMA及VIM蛋白表达水平术后28d，各组随机选取动物4只。于角膜缘后4mm处不同钟点位用7号针头抽取玻璃体液0.5mL，加入蛋白酶抑制剂，12000r/min离心15min，收集上清液，BCA法检测蛋白浓度。等量蛋白质经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶在TBST中室温封膜1h，并与α-SMA、VIM、GAPDH一抗混合后4℃孵育过夜；相应二抗室温下孵育1h；滴加ECL发光液，成像系统显影后使用Image J成像软件分析检测结果。实验重复3次。

1.2.5视网膜组织HE染色术后28d，各组动物经心内注射麻醉剂“安乐死”，立即摘除右眼眼球，置于FSA眼球固定液固定，梯度蔗糖溶液脱水，OCT包埋、冰冻、切片、HE染色，显微镜观察视网膜组织结构。

2结果

2.1玻璃体及视网膜改变情况术后28d，四组间TPVR分级差异有统计学意义(H=18.85，P<0.001，表1)，TA组、LU组、ART组分别与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，TA组分别与ART组、LU组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，表明TA、ART、LU均能有效抑制TPVR的发生。眼底照相及眼部B超结果显示，对照组可见视网膜前增殖膜及视网膜脱离；LU组玻璃体混浊，视网膜前膜状物形成，局部牵引；ART组玻璃体内增生条索，未出现牵拉性视网膜脱离；TA组未见增殖膜及视网膜脱离，仅出现玻璃体混浊(图1～2)。

表1 术后28d各组TPVR分级情况 眼

图1 眼底照相 A：术前正常兔眼眼底图像；B、C：术后28d对照组兔眼视网膜脱离及增殖膜形成；D：术后28d LU组兔眼视网膜前膜状物，髓线抬高；E：术后28d ART组兔眼玻璃体混浊，可见增生条索；F：术后28d TA组兔眼未见增殖膜，仅出现玻璃体混浊。

图2 眼部B超 A：术前正常兔眼部B超；B：术后28d对照组兔眼玻璃体混浊伴视网膜漏斗状脱离；C：术后28d LU组兔眼玻璃体混浊伴后脱离；D：术后28d ART组兔眼玻璃体混浊伴轻微后脱离；E：术后28d TA组兔眼玻璃体轻度混浊。

2.2玻璃体液中α-SMA及VIM蛋白表达水平Western Blot结果显示，术后28d四组兔眼玻璃体液中α-SMA和VIM蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.001，表2，图3)。TA组、LU组和ART组玻璃体液中α-SMA和VIM蛋白表达水平均低于对照组，LU组和ART组玻璃体液中α-SMA和VIM蛋白表达水平均高于TA组，ART组玻璃体液中α-SMA和VIM蛋白表达水平均低于LU组，差异均有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组玻璃体液α-SMA及VIM蛋白水平比较

图3 各组玻璃体液中α-SMA、VIM蛋白表达水平 A：Western Blot检测结果；B：四组玻璃体液α-SMA蛋白表达水平比较；C：四组玻璃体液VIM蛋白表达水平比较。bP<0.01 vs 对照组；dP<0.01 vs TA组；fP<0.01 vs ART组。

2.3视网膜组织HE染色结果术后28d，对照组兔眼视网膜各层排列紊乱，严重扭曲或局部断裂，各层结构不清晰，前膜明显增厚，视网膜明显脱离；LU组兔眼视网膜各层排列轻微扭曲，视网膜前可见炎性渗出，视网膜浅层脱离；ART组兔眼视网膜结构清晰，轻度水肿，可见浅层脱离；TA组兔眼视网膜各层结构清晰，排列尚整齐，局部可见视网膜褶皱，无视网膜脱离(图4)。

图4 术后28d视网膜病理变化 A：对照组结构紊乱，严重扭曲，视网膜脱离；B：TA组结构基本整齐正常，视网膜水肿；C：LU组视网膜前炎性渗出及视网膜浅层脱离；D：ART组视网膜结构紊乱，轻度水肿，视网膜浅层脱离。

3讨论

TPVR的形成过程是复杂的循环链式反应，是由多种因子及细胞作用的结果。眼外伤导致玻璃体和视网膜破裂，使得RPE细胞从Bruch膜中脱离。RPE作为TPVR的主要参与者，RPE细胞经历了上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程，同时巨噬细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞等迁入，并在各种细胞因子、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、VEGF等作用下产生间充质细胞等生物学效应，形成具有收缩作用的前膜，最终导致视网膜脱离[15-17]。本研究显示，TA、ART、LU均能通过抑制玻璃体液中α-SMA及VIM表达显著抑制玻璃体视网膜增生，表明TA、ART、LU均可有效抑制TPVR的发生发展，由此推测上述药物均参与延缓EMT进程，有望成为治疗TPVR的新方法。

既往研究表明玻璃体腔注射TA可以明显减少增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的发生[12]。TA可降低细胞免疫反应，对血-视网膜屏障起稳定作用，减轻炎症，抑制磷脂酶、前列腺素、白三烯等炎症因子的生成或释放，阻止炎症细胞移行[18]，且可抑制成纤维细胞分化、色素上皮细胞增殖、巨噬细胞和肥大细胞移行，具有抗增殖和抑制瘢痕形成的作用。α-SMA及VIM作为间充质细胞的间质标志物，已经被证实在PVR的形成过程中表达增加[19-20]。研究表明，诸多药物能够通过降低α-SMA及VIM的表达水平抑制RPE细胞的增殖，从而阻断EMT过程，能够显著缓解PVR的发生。白藜芦醇通过抑制SAMD4通路抑制经TGF-β2诱导的RPE细胞的EMT过程，且能降低α-SMA的表达，表明其能抑制TPVR的发生发展[21]；姜黄素可通过多种途径抑制RPE细胞的增殖和EMT过程[22]；藏红花素通过抑制p38的磷酸化降低VIM和α-SMA的表达，表明其能够有效抑制RPE细胞增殖、迁移和TGF-β2诱导的EMT过程[23]。上述中药提取物均可以通过抑制不同的信号通路抑制RPE细胞的增殖和迁移。

本研究发现，三组注药组玻璃体液中α-SMA及VIM蛋白含量均低于对照组，表明TA、ART、LU可能参与调控RPE细胞的EMT过程，抑制TPVR的产生。此外，玻璃体腔注射TA术后28d眼部B超显示仅有玻璃体轻度混浊；眼底图像未见增殖膜；TPVR分级明显低于对照组；病理切片显示视网膜各层结构清晰，排列尚整齐，仅出现视网膜水肿，表明TA可以抑制TPVR前膜的发生以及降低玻璃体液中α-SMA及VIM的表达，且效果优于ART和LU，提示TA对EMT过程具有更强的调控作用，这与王兆艳等[24]报道相似。但是，由于TA在临床中具有较多的不良反应报道，不利于其广泛应用。为寻更优于TA的药物，本研究选择ART和LU进行研究，ART和LU虽未见于在TPVR临床治疗中的应用，但本研究发现玻璃体腔注射ART及LU术后28d眼部B超及眼底图像显示玻璃体混浊，出现玻璃体增生条索及膜性物质；TPVR分级低于对照组；病理切片结构也较对照组清晰，提示ART和LU也能在一定程度上抑制α-SMA及VIM的表达，且显著抑制TPVR症状。近期也有研究证明，ART能够通过Smad3信号通路抑制ARPE-19细胞的增殖和收缩，从而抑制α-SMA及VIM的表达[25]，这与本研究结果相符。另有研究表明ART能抑制眼内新生血管[26-27]，抑制人卵巢癌细胞增殖以及通过抑制TGF-β1介导的肺泡上皮NF-κB及成纤维细胞的信号通路Jagged1、Notch1，从而抑制α-SMA及胶原的表达[28]。LU可通过抑制炎症标志物的表达和释放减轻眼部炎症，且与皮质类固醇抗炎效果相当[29]，且有学者证实LU可以保护视网膜神经节细胞及RPE细胞[29-31]。李茜等[32]研究发现LU可以通过抑制大鼠NF-κB信号通路减轻视网膜组织氧化应激及炎症损伤，而Jagged1、Notch1、NF-κB信号通路也参与TGF-β2介导的RPE细胞EMT过程。故推测ART、LU能通过抑制多种信号通路进一步抑制TPVR的产生，其在TPVR治疗中具有极大的潜在应用价值，但具体作用机制有待于进一步探索，未来研究中可以通过深入研究ART及LU对RPE细胞的作用揭示其抗TPVR发生的机制。

综上，玻璃体腔内注射TA、LU及ART均对TPVR具有抑制作用，其中TA效果最明显。ART和LU是潜在的有效药物，但是作用机制尚不明确，后期可通过研究具体的作用机制为开发抗增殖效果明显且毒副作用小的TPVR防治药物奠定基础。