代冬琴，韩莉苏，金星辰

(曲靖师范学院 生物资源与食品工程学院，云南 曲靖 655011)

物种多样性是指动物，植物和微生物种类的丰富性，它们是人类生存和发展的基础.物种多样性是生物多样性的中心，是生物多样性最主要的结构和功能单位.物种多样性包括两个方面：一方面是指一定区域内物种的丰富程度，可称为区域物种多样性；另一方面是指生态学方面的物种分布的均匀程度，可称为生态多样性或群落多样性.物种多样性是衡量一定地区生物资源丰富程度的一个客观指标.真菌Fungi是生物界中很大的一个类群，世界上已被描述的真菌约有1万属15万余种[1-6]，真菌学家戴芳澜教授估计中国大约有4万种[7].真菌广泛存在于土壤、空气、水等环境条件中，是地球上重要的生物类群之一，与人类的生产和生活息息相关，真菌作为分解者不仅参与生态系统中物质和能量的循环而且还与动植物形成不同程度的复杂的共生、寄生等关系，与人类的关系十分密切.目前世界范围内已报道的竹生真菌约650种，其中大部分为子囊菌[8-9].

1 研究区概况

云南省位于我国西南部，属于中低纬度，是我国自然条件最为复杂的省区之一[10].其地形由西北向东南倾斜，西北高，东南低，河流峡谷与山脉相间分布，境内海拔差异悬殊，山地纵横，湖泊众多.因其处在东南季风和西南季风控制之下，又受西藏高原区的影响，所以自然地理环境复杂多样，具有内陆近海性，边缘性，过渡性和封闭性的特征[11].云南省的气候变化受水平、垂直两个方向上的一致叠加而加倍，兼有寒温性、温性、暖温性、暖热性和热性等气候类型，具低纬气候、季风气候、山原气候的立体气候特点，全省年平均气温4℃～24℃之间，大部分地区15℃左右.特殊的地理环境和气候特点让云南省成为中国生物多样性最丰富的省份，具有丰富性、珍贵性和脆弱性的特点[12].云南是我国竹类植物物种最为丰厚的地区也是亚洲竹子分布中心[13-15]，为竹类真菌的多样性调查提供了不可替代的研究背景.

2 研究方法

2.1 样品采集与分离

根据云南竹林分布，将采样地分为滇中、滇南、滇东北、滇西北竹区，采样地点包括云南昆明、曲靖、玉溪、普洱、红河、西双版纳、德宏、昭通、大理、丽江、怒江和迪庆，采样时间从2017年至2021年，采集被子囊菌感染的竹子样本或凋落腐烂的枝、竿、叶、叶鞘、花、茎和根等，将采集的样品放入保鲜袋中带回实验室，并对未成熟的子实体进行保湿处理，采用单孢分离或组织分离法对新鲜的样品进行分离，获得纯培养菌株.

2.2 形态解剖

用体式显微境观察真菌子实体的形状、颜色和着生方式等，并对子实体宏观特征进行拍照；使用光学显微境观察子囊果、子座的内部结构和颜色，使用梅尔泽试剂(Melzer's reagent)检测子囊顶端结构(是否含淀粉质)，棉兰试剂(Lactophenol cotton blue)观察子囊壁结构，印度墨水(India ink)测试子囊孢子周围是否被胶质鞘包裹，使用乳酸液制作半永久玻片以备后续观察.同时将样本干燥后制做成标本保存于纸质信封.

2.3 DNA提取与测序

采用DNA真菌基因组试剂盒提取菌丝体DNA，部分无法获得菌株的样本，先用75%酒精消毒，再用无菌水清洗3次，晾干后，去除子座表皮，取子囊腔内子实层体于研钵内，加液氮磨成粉.基因组DNA的提取采用OMEGA E.Z.N.A.® Forensic试剂盒.DNA和PCR产物检测采用1%的西班牙琼脂糖凝胶电泳法[16].rDNA内转录间隔区(ITS)、小亚基rDNA(SSU)序列扩增和测序引物分别采用ITS5和ITS4以及NS1和NS4[17]；大亚基rDNA(LSU)序列扩增和测序引物采用LROR和LR5[18]；翻译延长因子1-α基因(TEF1-alpha)、RNA聚合酶II(RPB2)序列扩增和测序引物分别采用EF1-983F和EF1-2218R[19]以及fRPB2-5f和fRPB2-7cr[20].PCR反应体系和反应条件沿用参考文献[21].测序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成.采用BioEdit软件[22]读取序列并拼接，得到理想序列.

2.4 物种鉴定与多样性调查

采用ITS和LSU序列在GenBank数据库中分别进行blast比对，并结合构建系统发育树的分析方法鉴定物种，采用MAFFT软件[23]对单基因序列排列，并在MEGA6 6.0[24]中拼接ITS和LSU序列，由于SSU，TEF和RPB2基因在GenBank数据库中缺失较多，本研究多基因序列未包含上述基因序列，ITS和LSU多基因组合排列共624条序列(包括外类群AleurodiscusbambusinusHe4261和AgaricusmemnoniusHMAS 0278359)，总长度1 579 bp.采用在线软件(http://sing.ei.uvigo.es/ALTER/)转换PHYLIP格式，采用Findmodel 选择最优模型，采用最大似然法Maximum-likelihood (ML)通过软件RAxMLGUI v. 1.0[25-26]进行计算，采用1 000次重复，得到最优系统发育树以及支持率.ML树支持率采用MLBP表示，所得系统发育树通过TreeView[27]查看，并使用Adobe Illustrator CS v. 5进行编辑.在Index Fungorum中查询物种科、目、纲的分类地位并统计分析.

3 结果与分析

3.1 分子系统发育分析

基于ITS和LSU基因组合序列，利用GenBank数据库中已发表的431条竹生真菌序列和本研究所分离的211条菌株序列共计642条，以AleurodiscusbambusinusHe4261和AgaricusmemnoniusHMAS 0278359为外类群，使用RAxML软件[26]，采用最大似然分析法构建的ML树，建树模型为GTR+G+I (图1).研究揭示了竹生子囊菌物种间的亲缘关系，并估算物种间分化时间，确立种的分类地位.结合GenBank Blast比对结果，共鉴定标本300份，74个物种隶属座囊菌纲(Dothideomycetes)、Eurotiomycetes、Leotiomycetes和粪壳菌纲(Sordariomycetes).GenBank数据库中竹生真菌Arthrinium属和Roussoella属上传的物种序列较多.座囊菌纲包括了Astrosphaeriellaceae，Bambusicolaceae，Botryosphaeriaceae，Cladosporiaceae，Didymellaceae，Didymosphaeriaceae，Gloniaceae，Hysteriaceae，Occultibambusaceae，Parabambusicolaceae，Phaeosphaeriaceae，Roussoellaceae，Shiraiaceae，Strigulaceae，Tetraplosphaeriaceae和Tubeufiaceae等科；粪壳菌纲包含了Apiosporaceae，Bionectriaceae，Cephalothecaceae，Cordycipitaceae，Diaporthaceae，Distoseptisporaceae，Glomerellaceae，Hypocreaceae，Hypoxylaceae，Linocarpaceae，Oxydothidaceae，Vamsapriyaceae和Xylariaceae等科.

图1 基于ITS和LSU基因序列采用最大似然法构建的竹生子囊菌系统发育树

3.2 物种鉴定与多样性分析

本研究共采集样本300份，鉴定竹生子囊菌74个物种(表1)，其中，分布在滇中、滇南、滇东北、滇西北各生境的物种数分别为17、24、19、14(图2)，滇南竹林子囊菌分布的物种数最多，这可能与滇南属于热带气候，湿度较大、年温差较小、雨季降雨量充沛、森林覆盖面积大有关，适宜的环境促进了各类竹子生长，也为竹生真菌提供了良好的生长环境.滇中和滇东北地区平均海拔1 500米至1 800米，昼夜有一定温差，常年较为干旱，该地区最为常见的物种隶属节棱孢属Arthrinium，该属既能生长于高湿的滇南也能广泛寄生或腐生于干旱的滇中和滇东北，节棱孢属在世界范围内分布较广，目前寄主主要为禾本科植物，如竹子和其他草本植物，也有报道该属可寄生于蔷薇科或棕榈科，甚至在美洲有报道在人体皮肤分离了该属一物种[21].滇西北属于高寒区域，平均海拔达3 000米，该地区生长的竹类多为植株矮小的箭竹，竹生子囊菌物种多样性偏低，但其特殊地理条件对竹生药用菌的形成具有重要意义，目前所发现的3种野生药用竹生子囊菌(竹黄ShiraiabambusicolaHenn.、竹红RubroshiraiabambusaeD.Q. Dai & K.D. Hyde和竹肉球菌EngleromycessinensisM.A. Whalley et al.)均分布于滇西北区域(丽江、大理、怒江和香格里拉)，该研究对野生药用菌的开发提供了基础理论数据.

通过对竹生子囊菌各纲、目、科、属的多样性分析，表明云南竹生子囊菌类群主要隶属粪壳菌纲(Sordariomycetes)占比60.85%和座囊菌纲(Dothideomycetes)占比37.01%，少数隶属散囊菌纲(Eurotiomycetes)和锤舌菌纲(Leotiomycetes)(图2)，物种分布较多的目为Botryosphaeriales、Hypocreales、Pleosporales和Xylariales分别占比3.88%、4.64%、32.95%和42.64%(图3)，分布较多的科为Apiosporaceae、Bambusicolaceae、Botryosphaeriaceae、Roussoellaceae和Xylariaceae占比分别为36.62%、5.28%、3.52%、13.38%和4.32%(图4)，分布较多的属为Arthrinium、Bambusicola和Roussoella占比分别为14.78%、4.93%和7.39%(图5)，Arthrinium和Botryosphaeriaceae是植物常见病原菌类群，该发现对竹类植物的病害防控与资源保护具有参考价值.

图2 云南竹生子囊菌各区域物种统计(A)和各纲物种占比(B)

图3 云南竹生子囊菌类群各目物种分布

图4 云南竹生子囊菌类群各科物种分布

图5 云南竹生子囊菌类群各属物种分布

表1 云南竹生真菌鉴定统计表

(续表)

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(续表)

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4 讨 论

早期的竹类真菌研究主要集中在日本，大部分以比较形态学为鉴定依据，21世纪后在中国香港和泰国等地相继应用分子手段开展了竹生真菌多样性和分类研究，这使得竹生真菌的命名和物种的分类地位发生了改变.国内外报道的竹生真菌已超过650种[8,21]，其中绝大部分为子囊菌.国内已记录的竹生子囊菌隶属座囊菌纲Dothideomycetes、散囊菌纲Eurotiomycetes和粪壳菌纲Sordariomycetes，分别包含5目Capnodiales、Dothideales、Myriangiales、Pleosporales、Tubeufiales9科Balladynaceae、Capnodiaceae、Didymellaceae、Didymosphaeriaceae、Leptosphaeriaceae、Myriangiaceae、Phaeosphaeriaceae、Saccotheciaceae、Tubeufiaceae9属12种普通胶壳炱(ScoriascommunisYamam)、刚竹亚球腔菌(MetasphaeriadenataSyd.)、竹鞘多腔菌(MyriangiumharaeanumTai et Wei)、亚隔孢壳(DidymellamaculosaPenz. et Sacc.)、美形亚隔孢壳(Didymellaeumorpha(Berk. et Curt.) Sacc.)、青篱竹隔孢球壳(DidymosphaeriaarundinariaeEll. et Ev.)、梭隔孢球壳(DidymosphaeriafusisporaPenz.)、疣孢小球腔菌(LeptosphaeriascabrisporaTeng)、虑斑小球腔菌(LeptosphaeriatigrisoidesHara)、竹暗球腔菌(PhaeosphaeriabambusaeMiyake et Hara)、竹生棘点壳(AcanthostigmabambusicolaTeng & S.H. Ou)、孝竹刺炱(BalladynalelebaeYamam.)；1目Chaetothyriales1科Chaetothyriaceae2属2种小刺盾炱(ChaetothyriumechinulatumYamam)、刺三叉孢炱(Triposporiopsisspinigera(Höhn) Yamam)和6目Amphisphaeriales、Chaetosphaeriales、Hypocreales、Magnaporthales、Phyllachorales、Xylariales13科Amphisphaeriaceae、Apiosoiraceae、Bionectriaceae、Ceratosphaeriaceae、Chaetosphaeriaceae、Clavicipitaceae、Hypocreaceae、Nectriaceae、Niessliaceae、Hyponectriaceae、Phyllachoraceae、Xylariaceae16属23种梭孢圆孔壳(Amphisphaeriafusispora(Syd.) Teng)、星形圆孔壳(AmphisphaeriastellataPal.)、Chaetosphaeriamacrospora(Kawam) Hara)、刚竹假竹黄(ShiraiellaphyllostachydisHara)、麦角菌(Clavicepspurpurea(Fr.) Tul.)、箬竹丛枝病菌(Epichlo⊇sasaeHara)、草野弯孢壳(Epichlo⊇kusanoiP. Henn.)、刚竹类肉座菌(HypocreopsisphyllostachydisMiyake et Hara)、刺竹丽赤壳(Calonectriabambusae(Hara) Höhn.)、美胶孢球壳(ExomassarinulacalosporaTeng)、毛竹喙球壳菌(CeratosphaeriaphyllostachydisS.X. Zhzng)、青篱竹垫座菌(Coccostromaarundinariae(Hara) Teng)、梭孢四胞座壳(Phragmocarpellafusispora(Syd. & P. Syd.) Syd. & P. Syd.)、竹黑痣菌(PhyllachoragracilisSpeg.)、孝顺竹黑痣菌(PhyllachoralelebaeSaw.)、蒙塔涅梨假壳(ApiosoiramontagneiSacc.)、竹茎囊孢壳(PhysalosporareinkingianaSacc.)、奇异小花口壳(Anthostomellamirabilis(Berk. et Br.) Höhn.)、亮小花口壳(Anthostomellanitidissima(Dur. et Mont.) Sacc.)、深埋小花口壳(AnthostomellaprofundaSacc.)、白井小花口壳(Anthostomellashiraiana(Miyake et Hara) Hara)、条纹小花口壳(AnthostomellastriolaSacc.)、秆生座坚壳(RoselliniaculmicolaTeng)[8,13]，而云南作为我国竹子种类最为丰富的省份，报道的竹生真菌种类却十分有限，大量竹生真菌有待进一步被发现.

本研究在云南滇中、滇南、滇东北和滇西北等地区共采集竹生真菌300份，通过分子研究手段，分离出211条ITS和LSU基因组合片段，共鉴定出74个物种，分属4纲、18目、29科、40属.研究中一部分样本由于与已知分子序列相近度低，无法仅仅通过分子手段鉴定到种，该部分样本未列出，后续需进一步增加基因片段进行物种鉴定.由此可见云南竹生真菌多样性较高，尤其在湿度较大和温度较高的滇南地区，物种多样性较为突出.

此外，本研究发现云南野生药用竹生真菌竹黄、竹红和竹肉球菌均采集于滇西北地区，竹黄作为我国传统中药，是一味非常著名的中药材，治虚寒胃痛、风湿性关节炎、坐骨神经痛、跌打损伤、筋骨酸痛等，在我国南方民间具有很长的药用历史[28]，其子座内含有光明化合物竹红菌素(Hypocrellin)，该活性物质具有较好的开发前景，如临床医学上利用竹红菌素研制的软膏可用于治疗阴部白斑.本研究为上述药用竹生菌的进一步开发研究奠定了基础.