段 奕，倪昌雯，王敏华，孙素姣，黄 玲*

（1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.大理大学第一附属医院，云南大理 671000）

人体皮肤日常接触的阳光中含有大量的紫外线（ultraviolet，UV），主要由长波紫外线UVA（320～400 nm）和中波紫外线UVB（280～320 nm）组成〔1〕。其中UVB 是造成皮肤光损伤的主要成分，其能量较高，能作用于皮肤表皮的角质形成细胞，被DNA直接吸收并生成环丁烷嘧啶二聚体等光合物，导致DNA 损伤〔2-4〕。细胞在DNA 受损后将阻滞细胞周期，启动DNA 修复可使DNA 恢复正常结构〔5〕。若修复效率较低，为维持内环境稳定，细胞将通过激活半胱氨酸蛋白酶家族（cysteine-dependent aspartate-specific protease，Caspase），进一步诱导细胞凋亡〔5-6〕。同时，UVB 还可使细胞产生过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重细胞损伤。ROS 能破坏细胞的氧化还原稳态并引发严重的氧化应激反应，从而破坏蛋白质、核酸、脂质和线粒体等的结构，激活细胞的死亡受体途径，加重细胞损伤和凋亡〔7-8〕。细胞凋亡是一个受高度调控的细胞程序性死亡过程，目的是清除DNA 受损的细胞〔9〕。避免受损细胞过多时，部分未修复的受损细胞未被清除发生突变，导致光线性皮肤疾病和皮肤癌的发生〔10〕。为减少紫外线引起的皮肤损伤，开发具有抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡特性的生物活性药物非常重要。大量研究发现一些天然物质（如黄酮类化合物）可用于预防和治疗由UVB 引起的皮肤疾病〔11〕。黄酮类化合物是一类多酚类化合物，具有抗氧化、杀菌和抗炎等特性〔12〕。7-羟基异黄酮是从天然植物中分离出的异黄酮类单体，异黄酮类是黄酮类化合物的6 个主要亚类之一，具有与黄酮类化合物相似的生物学特性〔13〕。7-羟基异黄酮在异黄酮类化合物中为化学结构较简单的分子，分子式为C15H10O3。目前发现，7-羟基异黄酮在体外实验中能有效抑制手足口病相关病毒的活性，可进一步用于药物研发〔14〕。但对7-羟基异黄酮在预防和治疗其他疾病的研究较少。为扩大异黄酮类化合物的应用范围，本实验研究了7-羟基异黄酮对HaCaT细胞增殖和UVB 引起的细胞光损伤的影响，并进一步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 试剂7-羟基异黄酮（批号：OTV000035，美国Sigma-Alderich 公司）；二甲基亚砜（DMSO，批号：D8371，美国Sigma-Alderich 公司）；0.25%胰蛋白酶（批号：25200056，美国Sigma-Alderich 公司）；胎牛血清（FBS，批号：04-002-1A，德国VivaCell 公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，批号：8120494，美国Gibco公司）；DMEM 高糖培养基（批号：8120311，美国Gibco 公司）；青/链霉素/两性霉素B（批号：03-033-1B，以色列BI 公司）；CCK-8 试剂盒（批号：IN08-1000，武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗（批号：SA00001-2，武汉三鹰生物技术有限公司）；RIPA 裂解液（批号：R0010，北京索莱宝科技有限公司）；ROS 检测试剂盒（批号：CA1410，北京索莱宝科技有限公司）；抗Caspase-8（批号：ab32397，英国Abcam 公司）；抗裂解PARP1兔单克隆抗体（批号：ab32064，英国Abcam 公司）；抗Beta-actin 兔单克隆抗体（批号：ac026，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：MP206，上海碧云天生物技术有限公司）；膜再生液（TBST，批号：SW3020，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器3111 细胞培养箱、1300-A2 生物安全柜、Micro 17R 低温超高速离心机（美国赛默飞公司）；SS-04A 紫外线光疗仪、UVB 辐照度监视器（上海希格玛公司）；Biotek Synergy H1 多功能酶标仪（美国伯腾公司）；垂直电泳仪、电泳槽（美国伯乐公司）；5200Multi 化学发光凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

1.3 细胞人角质形成细胞系HaCaT 细胞（批号：KCB200442YJ）购自中国科学院昆明野生动物细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养用DMEM 培养基（含10% FBS 和1% 青/链霉素/两性霉素B），在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。2～3 d 更换培养基，待细胞长至T25 细胞培养瓶的70%～90% 时进行传代，实验选取处于对数生长期且生长状态良好的HaCaT 细胞。

2.2 实验分组与UVB 照射实验设对照组及实验组，对照组未经任何处理；实验组分为7-羟基异黄酮组（以下简称“药物组”）、UVB 照射组（以下简称“UVB 组”）及用7-羟基异黄酮预处理的UVB 照射组（以下简称“药物+UVB 组”）。7-羟基异黄酮用DMSO 溶解后，－20 ℃保存。UVB 照射方法：用紫外线光疗仪对细胞进行UVB 照射，照射距离25 cm，并用UVB 辐照度监视器监测辐照剂量。根据前期的实验结果和公式：UVB 照射剂量=照射时间×UVB强度，设定UVB 照射强度为30 mJ/cm2，照射时长根据监视结果进行调整。照射前去除培养基并用少量PBS 覆盖，避免细胞干燥。照射结束后根据需要进行下一步实验或更换DMEM 培养基继续培养24 h 再进行实验。

2.3 CCK-8 法测定细胞增殖活性将HaCaT 细胞按6×103个/孔的密度接种于96 孔板并培养过夜，待细胞完全贴壁后加入不同浓度的7-羟基异黄酮溶 液（6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00，400.00，800.00 μmol/L），每个浓度设3 个复孔。24 h 后去除培养基，每孔加入100 μL 含CCK-8 的无血清培养基（体积比为1∶10），置于细胞培养箱孵育1 h。用酶标仪测量各孔于450 nm 处的吸光度（OD）值，计算用于表示细胞增殖活性的细胞存活率：细胞存活率（%）=［（实验组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD值-空白组OD 值）］×100%。（空白组内不含细胞和待测物质，仅有无血清培养基和CCK-8）

2.4 细胞内ROS 检测将HaCaT 细胞按1×105个/孔的密度接种于12 孔板内并培养过夜，待细胞完全贴壁后加入200 μmol/L 7-羟基异黄酮处理24 h，再经UVB 照射。照射结束后吸除PBS，每孔加入500 μL 含二氯荧光黄双乙酸盐（dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA）的检测液（用无血清培养基按1∶1 000 稀释DCFH-DA，使其浓度为10 μmol/L），置于细胞培养箱孵育20 min。用无血清培养基洗涤细胞3 次，使用酶标仪在488 nm 激发波长，525 nm发射波长下测定荧光强度。

2.5 蛋白质印迹法检测Caspase-8 及PARP1 的表达将HaCaT 细胞接种于3.5 cm 平皿中，培养至细胞50%～60% 融合后加入200 μmol/L 7-羟基异黄酮处理24 h，经UVB 照射后，更换培养基继续培养24 h。收集细胞并加入含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解缓冲液，置冰上裂解20 min；4 ℃下13 000 r/min 离心15 min，取上清液，用BCA 试剂盒测定上清液蛋白浓度。用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离约20 μg 蛋白并转移至聚二氟乙烯膜上，5% 脱脂牛奶室温封闭60 min。将膜分别与抗Caspase-8（1∶1 000）、聚ADP-核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase，PARP1）（1∶1 000）或Beta-actin（1∶5 000）孵育，4 ℃过夜，次日用TBST 缓冲液洗膜3 次，每次10 min。与各自种属特异性的二抗室温孵育60 min，TBST 缓冲液洗涤3次，每次10 min。使用ECL 化学发光法显色，并用成像仪拍照以观察蛋白表达。使用Image J 软件分析蛋白条带，Beta-actin 作为内参。将待测的蛋白条带导入Image J 软件，修改图片为8-bit 格式的灰度图片，调整曝光，消除图片背景影响。设置测量指标和单位，分别框选待测条带中的各个泳道，通过测量积分光密度得出灰度值。该值即为可视化蛋白表达量。将测量出的目标蛋白灰度值除以对应泳道的内参蛋白灰度值，得到目标蛋白的相对表达量。

2.6 统计分析用SPSS 20.0 软件对数据进行分析，数据以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，不同组间的比较使用独立样本t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度7-羟基异黄酮对HaCaT 细胞增殖活性的影响不同浓度的7-羟基异黄酮对HaCaT 细胞增殖活性的影响存在差异，浓度为6.25、12.50、100.00、200.00、400.00 μmol/L 时7-羟基异黄酮对HaCaT 细胞的增殖活性影响显著，细胞存活率均明显高于对照组（P＜0.01）。上述浓度处理的细胞存活率分别为：136.3%±6.7%、132.0%±15.6%、143.2%±10.2%、186.2%±11.8%、148.6%±10.1%。7-羟基异黄酮浓度在100～400 μmol/L 时对细胞的增殖活性影响最为显著，200 μmol/L 时细胞存活率达到峰值，当浓度增加到800.00 μmol/L 则显著抑制细胞增殖活性，细胞存活率为33.0%±4.8%。见图1。故后续实验选择7-羟基异黄酮浓度为200 μmol/L。

图1 不同浓度7-羟基异黄酮对细胞增殖活性的影响

3.2 7-羟基异黄酮对细胞内ROS 水平的影响DCFH-DA 是一种荧光探针，它在细胞内经脱乙酰过程后可被细胞内ROS 氧化生成荧光产物。在特定波长下对生成物的荧光强度进行检测可以反映出细胞的ROS 生成量。与对照组相比，药物组中的ROS 生成量降低（P＜0.01）；UVB 组中的ROS 生成量显著升高（P＜0.01）。UVB 组与药物+UVB 组比较发现，药物+UVB 组的ROS 生成量较UVB 组明显下降（P＜0.01）。见图2。

图2 7-羟基异黄酮对细胞ROS 生成量的影响

3.3 7-羟基异黄酮对细胞凋亡相关蛋白PARP1 和Caspase-8 的影响与对照组相比，药物组中Caspase-8 蛋白相对表达量无明显变化（P＞0.05），PARP1 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.01）；UVB组PARP1 和Caspase-8 蛋白相对表达量都显著升高（P＜0.01）。药物+UVB 组与UVB 组比较，Caspase-8蛋白的相对表达量降低（P＜0.05），PARP1 蛋白的相对表达量显著减少（P＜0.01）。见图3。

图3 7-羟基异黄酮对PARP1 和Caspase-8 蛋白表达的影响

4 讨论

紫外线诱导的细胞凋亡是一个复杂过程，涉及多种途径，例如生成大量ROS、激活细胞表面死亡受体及DNA 损伤。过度暴露于UVB 会损伤表皮的角质形成细胞，使蛋白质、DNA、脂质膜和许多其他重要分子的结构发生改变，导致皮肤发生晒伤、炎症、增生、皮肤老化和皮肤癌等多种病理变化。天然植物的活性成分，具有紫外线吸收、抗氧化和抗炎等特性，可作为天然的光保护剂，用于预防和减少紫外线对皮肤的损害〔15〕。既往许多研究报道，黄酮类化合物如木犀草素、儿茶素和原花青素C1 等均具有较好的抗氧化作用，并且能减少UVB 对皮肤的损伤，提供光保护作用。对于抗UVB 光损伤的药物仍处于研究阶段，目前暂无法选择合适的阳性药物作为对照，为丰富抗UVB 光损伤的药物，我们对7-羟基异黄酮进行了研究。通过在UVB 照射前用7-羟基异黄酮预处理HaCaT 细胞，观察该药物对HaCaT 细胞的增殖活性和UVB 诱导细胞凋亡的影响，发现作为天然异黄酮类提取物的7-羟基异黄酮，在适宜浓度下能促进正常HaCaT 细胞增殖，抑制UVB 照射后细胞ROS 的产生，并有效抑制UVB诱导的细胞凋亡。减少UVB 对细胞的损伤，为细胞提供光保护作用。

细胞在生理状态下可产生一定量的ROS，而机体自身的抗氧化系统，能拮抗ROS 的作用，维持细胞氧化还原稳态。当UVB 照射时间过长或照射剂量过高时，可诱导细胞产生大量ROS，对细胞DNA、蛋白质和脂质等大分子物质造成损伤。据报道，约50%由UVB 诱导的细胞损伤是通过ROS 水平升高引起的〔16〕。同时，ROS 介导的信号级联反应被激活，促使细胞发生大量凋亡〔17-18〕。本实验研究发现，HaCaT 细胞在生理状态下可产生ROS，由于抗氧化系统的作用，使细胞处于氧化还原稳态中。用7-羟基异黄酮处理的细胞ROS 生成量下降，提示7-羟基异黄酮可使细胞氧化还原稳态维持在较低的状态，减轻机体抗氧化系统的压力。暴露于UVB 中的细胞会产生大量ROS，破坏氧化还原稳态，损伤细胞。与未加7-羟基异黄酮的UVB 照射组相比，使用7-羟基异黄酮预处理的细胞中ROS 生成量大幅降低，与细胞生理状态下的ROS 水平相近。说明7-羟基异黄酮具有较强的抗氧化性，能有效抑制UVB照射前后HaCaT 细胞中ROS 的生成，尤其是能显著降低UVB 照射后的ROS 水平。可作为外源性抗氧化剂，降低ROS 对细胞的损伤，维持细胞稳态，减少细胞凋亡。

Caspase 蛋白家族在细胞凋亡过程中发挥着非常重要的作用，能介导以Caspase-8 为启动子的外源性凋亡和以Caspase-9 为启动子的内源性凋亡两种主要的凋亡途径〔19〕。有研究报道，在没有死亡受体配体的情况下，UVB 能够特异性激活Caspase-8，启动外源性细胞凋亡〔20〕。PARP 是一种核酶，负责核酶和染色体蛋白的核糖基化〔21〕。细胞凋亡后期DNA 链的断裂是激活PARP1 的主要原因。因此，PARP1 在DNA 的修复和细胞凋亡中起着关键作用。PARP1 作为Caspase 蛋白家族的底物，也是细胞凋亡的特异性标志物〔22〕。本实验通过蛋白质印迹法检测发现，UVB 照射后与细胞凋亡相关的蛋白Caspase-8 及PARP1 表达量均上升，说明UVB 可诱导细胞发生外源性凋亡，并造成DNA 链的断裂，进一步激活PARP1。在UVB 照射前使用7-羟基异黄酮预处理则发现Caspase-8 的表达量明显降低，提示7-羟基异黄酮可能通过靶向作用于Caspase-8来抑制UVB 诱导的外源性细胞凋亡。

使用7-羟基异黄酮预处理的UVB 照射组中PARP1 蛋白表达量明显降低，仅为UVB 组的一半，表明7-羟基异黄酮对减少UVB 诱导的细胞凋亡和DNA 损伤有非常显著的效果。这可能是由于7-羟基异黄酮一方面能直接保护细胞，避免UVB 被DNA 直接吸收使DNA 链发生断裂。另一方面，7-羟基异黄酮通过降低UVB 照射后ROS 的生成，减少氧化应激反应对DNA 的损伤，间接对细胞提供保护作用。综上所述，7-羟基异黄酮具有促进细胞增殖，减少细胞对UVB 的吸收，降低细胞内ROS 生成和抑制UVB 诱导的细胞凋亡等特性，对细胞具有光保护作用，可用于预防UVB 引起的细胞损伤。